硝基苯類化合物微生物降解研究進展

硝基苯類化合物微生物降解研究進展

1硝基苯類污染環(huán)境修復(fù)方法硝基苯磺酸具有廣泛的應(yīng)用于農(nóng)藥、染料、爆炸、橡膠、其他原料的生產(chǎn)。環(huán)境中的硝基苯磺酸主要包括硝基苯、硝氯苯、硝基苯酚、硝基苯胺和硝基苯甲酸。硝基苯磺酸具有廣泛的用途。它可以通過廢水進入環(huán)境，也可以由于運輸和生產(chǎn)過程中的意外事故和儲存罐的不當(dāng)處理而進入環(huán)境。大多數(shù)硝基苯磺酸具有穩(wěn)定性、高毒性和易生物積累的特點。已被列入美國國家環(huán)境管理局（epa）和中國環(huán)境監(jiān)督管理總局的污染物名單。硝基苯類污染環(huán)境的修復(fù)方法主要包括物理法、化學(xué)法和生物法.物理法主要是利用多孔樹脂和活性炭等吸附污染物;化學(xué)法主要是利用氧化反應(yīng)來消除污染物;生物法主要是利用人工馴化或構(gòu)建的工程菌來降解污染物,最終使污染物礦化.與化學(xué)法和物理法相比,生物處理法的優(yōu)點是費用低,不易造成二次污染,可最大程度地降低污染物的濃度,應(yīng)用范圍廣.同時,含有硝基苯類化合物的廢水往往是多種污染物共存,利用微生物之間的協(xié)同作用和微生物對底物的共代謝效應(yīng),能夠同時去除多種污染物,加快硝基化合物的降解.因此,隨著生物強化技術(shù)和基因工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用和發(fā)展,在防治硝基苯類化合物的環(huán)境污染方面,生物處理法具有廣闊的應(yīng)用前景.在過去的幾十年里,環(huán)境科技工作者不僅在宏觀上研究了微生物生態(tài)系統(tǒng)對污染環(huán)境的修復(fù),而且在微觀上對降解菌的分離和純化、降解質(zhì)粒的分離和基因工程菌的構(gòu)建進行了研究.本文從降解菌的馴化篩選、降解途徑、降解機理、共代謝、趨化性和分子遺傳學(xué)角度,闡述了硝基苯類化合物生物降解的最新研究進展.2硝基苯類化合物的降解硝基的親電子性、苯環(huán)結(jié)構(gòu)的對稱性使得硝基苯類化合物不易被微生物降解,并且隨著苯環(huán)上取代硝基的增多,生物降解性逐漸降低.國內(nèi)外學(xué)者在菌種的馴化和篩選方面進行了大量的研究.降解菌主要來自受污染的土壤、地下水、地表水、活性污泥及河道底泥等;在馴化過程中使用單一菌源或混合菌源.馴化培養(yǎng)基是以硝基苯類化合物為唯一碳源、氮源、能源,或以硝基苯類污染物為唯一氮源而琥珀酸鹽或其它易降解底物為唯一碳源和能源的液體培養(yǎng)基,其目標(biāo)物加入濃度≥0.5mmol·L-1.利用單一或混合目標(biāo)物,在30℃~35℃、轉(zhuǎn)速為150~200r·min-1、pH為7.0~7.5條件下好氧振蕩培養(yǎng)或厭氧培養(yǎng).Haigler等利用硝基苯污染的土壤和底泥,馴化培養(yǎng)出1株能以2-硝基甲苯為唯一碳源和氮源的Pseudomonassp.JS42菌株.Lenke等利用2,4-二硝基苯酚為唯一氮源、琥珀酸鹽為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基,馴化培養(yǎng)出RhodococcuserythropolisHL24-1和HL24-2兩種菌株.實驗結(jié)果表明,這兩種菌株均能以2,4-二硝基苯酚作為唯一的氮源和碳源.由于硝基苯類化合物不易徹底降解,所以可以分別馴化和篩選降解目標(biāo)污染物和中間代謝產(chǎn)物的降解菌,再利用混合菌徹底降解硝基苯類化合物.由于硝基苯類化合物的降解酶大多數(shù)為誘導(dǎo)酶,并且很多結(jié)構(gòu)相似的化合物其初始降解途徑相同,因此,可以利用較易被微生物降解的低毒性化合物,馴化培養(yǎng)出高毒性且難降解的同類化合物的降解菌.例如,以硝基苯為唯一碳源和氮源馴化培養(yǎng)出的菌株,能夠降解3-氯硝基苯和4-氯硝基苯.部分國內(nèi)外學(xué)者篩選和馴化的硝基苯類化合物降解菌和初始降解酶見表1.3帶的路徑和機制3.1氧化反應(yīng)的代謝路徑3.1.1pseudom根硝基苯類化合物在加氧酶的作用下脫掉苯環(huán)上的硝基,形成相應(yīng)的酚,進一步由雙加氧酶作用,開環(huán)降解形成烯酸類物質(zhì),而脫除的硝基形成亞硝基鹽,可被微生物利用為氮源.例如,2,4-二硝基甲苯首先被氧化成4-甲基-5-硝基兒茶酚,最后降解為2-羥基-6-氧-2,4-二烯酸.PseudomonasputidaFl和Pseudomonassp.JS150首先將4-硝基甲苯氧化成3-甲基-6-硝基兒茶酚.Pseudomonassp.JS51降解間硝基苯甲酸時,先是在3,4-雙加氧酶的作用下形成3,4-二羥基苯甲酸,然后在4,5-雙加氧酶的作用下,開環(huán)降解.2,6-二硝基甲苯被雙加氧酶氧化成3-甲基-4-硝基兒茶酚.對硝基酚在1,2-雙加氧酶作用下形成4-硝基兒茶酚,接著脫硝基形成1,2,4-苯三醇,最終降解.對硝基苯酚和2,2-聯(lián)吡啶共存時,Moraxellasp.菌株可通過單加氧酶將對硝基苯酚脫硝基氧化成對苯二酚.3.1.2雙加氧酶法pseudom根治化硝基苯類化合物可以在加氧酶的作用下進行不脫硝基的初始降解.例如,甲苯降解菌PseudomonasputidaF1和Pseudomonassp.JS150在以2-硝基甲苯和3-硝基甲苯為唯一碳源生長時,初始降解產(chǎn)物分別為2-硝基芐醇和3-硝基芐醇,然后再將其降解為硝基苯甲酸.4-硝基甲苯在Pseudomonassp.4NT的作用下,首先被氧化成對硝基苯甲酸,接著進行硝基還原和脫氨作用,最后生成烯二酸類物質(zhì).雙加氧酶可直接作用于苯環(huán),形成硝基鄰苯二酚,再進一步開環(huán)降解.Haigler等報道,先用含甲苯的培養(yǎng)基培養(yǎng)惡臭假單胞菌菌株,誘導(dǎo)產(chǎn)生甲苯2,3-雙加氧酶,再用硝基苯培養(yǎng),硝基苯被轉(zhuǎn)化成3-或4-硝基鄰苯二酚,而后進一步開環(huán)降解.3.2n-fmo-4-羥基芳香化合物及乙酰胺的合成硝基苯類化合物的還原代謝主要是硝基被還原為亞硝基、羥氨基,再根據(jù)具體的環(huán)境選擇降解途徑,主要有以下幾種:1)在羥氨基裂解酶的作用下脫氨基,形成二羥基芳香化合物.ComamoaasacidovoransNBA-10菌株降解4-硝基苯甲酸時,首先生成4-羥氨苯甲酸鹽,接著生成3,4-二羥基苯甲酸鹽.2)硝基還原生成芳香胺.在有氧條件下,脫氨基生成相應(yīng)的二羥基芳香化合物,開環(huán)或直接氧化開環(huán),再脫氨基.3)羥氨基還原成氨基后經(jīng)乙酰化作用生成乙酰胺.Rhodosporidiumsp.菌株可通過硝基還原途徑轉(zhuǎn)化對氯硝基苯,終產(chǎn)物為4-氯-乙酰苯胺和4-氯-2-羥基-乙酰苯胺.4共代謝與多株昆蟲共生體的分解4.1其它微生物的協(xié)同作用Leadbetter和Foster在1959年發(fā)現(xiàn)甲烷產(chǎn)生菌P.methanica在甲烷存在的情況下能夠?qū)⒁彝檠趸梢掖?、乙醛和乙?但是乙烷及其任何一種代謝產(chǎn)物對甲烷細(xì)菌的生長沒有任何作用,將這種現(xiàn)象稱為共氧化.后來Jesen將其進行了拓展,提出了微生物共代謝作用的概念.一些難降解的有機化合物不能直接作為碳源或能源物質(zhì)被微生物利用,而當(dāng)環(huán)境中存在其它可利用的碳源或能源時,難降解有機化合物才能被利用,這樣的代謝過程稱為共代謝作用.例如,20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn),一株假單胞菌不能單獨利用三氯乙酸作為碳源生長,但在一氯乙酸存在時可以使三氯乙酸脫氯.微生物共代謝作用的發(fā)生有以下幾種情況:1)依靠降解其它有機物提供能源,例如,直腸棱菌需要有蛋白胨類物質(zhì),才能降解丙體六六六;2)依靠其它微生物的協(xié)同作用,例如,農(nóng)藥二嗪農(nóng)的嘧啶基環(huán)的降解需要鏈霉菌和節(jié)桿菌共同協(xié)作,而兩菌各自單獨存在則不起作用;3)先經(jīng)別的物質(zhì)誘導(dǎo),例如,一株銅綠假單胞菌經(jīng)正庚烷誘導(dǎo)才產(chǎn)生相應(yīng)的羥化酶系.微生物共代謝作用的機理雖然目前尚存在爭論,但通常的解釋是:微生物在生長基質(zhì)的誘導(dǎo)下,產(chǎn)生專一性不強、底物范圍較寬的誘導(dǎo)降解酶,在與生長基質(zhì)共存時,這種誘導(dǎo)酶可實現(xiàn)對非生長基質(zhì)的部分降解;在生長基質(zhì)被完全消耗時,休眠細(xì)胞通過內(nèi)源代謝可以維持誘導(dǎo)酶的活性,繼續(xù)對非生長基質(zhì)進行轉(zhuǎn)化.由于微生物共代謝作用,能夠產(chǎn)生一些新的代謝途徑,而且對多種有機污染物共存體系具有較高的降解能力.共代謝在難降解的有毒有機污染物的去除和污水處理領(lǐng)域具有重要作用.從基質(zhì)的角度可以將共代謝研究分為兩個方面:1)以易被微生物降解的無毒有機物作為共代謝的生長基質(zhì),例如,Acinetobactersp.ODDK71菌株在以十六烷作為生長基質(zhì)時,以共代謝的方式對烷基環(huán)己烷進行降解.Horvath等研究表明,氟苯甲酸鹽不能被土壤混合微生物作為生長基質(zhì)利用,但和葡萄糖共存時可被完全降解.硝基苯和琥珀酸鹽共存時容易被微生物降解.吉氏擬桿菌和屎擬桿菌等菌株能夠與葡萄糖共代謝,還原硝基苯,1g葡萄糖共代謝還原200~260mg硝基苯.環(huán)糊精可以提高降解菌對硝基苯的耐受濃度,縮短降解菌的停滯時間,促進降解菌的生長,加快硝基苯的降解.3-氯硝基苯和4-氯硝基苯在和琥珀酸鹽共存時,可被Pseudomonasputida部分降解.2)對于化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的有機物共存體系,通過較易降解的有機物來誘導(dǎo)關(guān)鍵的降解酶系,從而降解較難降解的有機物.例如,硝基苯誘導(dǎo)降解菌可以降解硝基氯苯;甲苯降解菌可以降解硝基甲苯.由于污染環(huán)境中有機物成分的復(fù)雜性和工業(yè)廢水組成的多樣性,在實際工作中微生物共代謝還應(yīng)用于不同有機污染物共存時相互作用的研究方面.例如,2,6-二硝基甲苯抑制2,4-二硝基甲苯降解菌的降解活性.苯胺對硝基苯的還原反應(yīng)為協(xié)同作用.雖然假單胞菌能夠以苯酚作為唯一的碳源,但是苯能夠抑制苯酚水解酶的產(chǎn)生,所以假單胞菌無法代謝苯酚與苯的混合物.4.2菌種體系對微生物降解的影響在自然條件下,有機物的降解往往是在由多菌屬微生物組成的群落水平上進行的,即相關(guān)的微生物群體單獨存在時不能代謝,只有生活在一起時才能完成.微生物之間的這種協(xié)作關(guān)系在難降解有機污染物的生物降解菌人工合成方面具有重要作用.例如,對硝基苯類污染物而言,由于單個菌種往往不具備一整套完整的降解酶系或基因成分,在用單一微生物進行的純培養(yǎng)中,往往難以實現(xiàn)污染物的礦化.自然環(huán)境中多種微生物并存,單一培養(yǎng)的微生物在實際應(yīng)用中還面臨生存競爭問題.因此,開展多菌株復(fù)合體的微生物降解研究具有重要的理論與實踐意義.一方面,多菌株體系能夠利用優(yōu)勢菌株來適應(yīng)變化的環(huán)境,這一特點可以保證易變環(huán)境中污染物的降解效果;另一方面,可以通過不同菌株的協(xié)同作用實現(xiàn)難降解有機物的部分或徹底降解.目前,利用混合菌進行的降解研究主要包括:1)以共存污染物的單一組分為唯一基質(zhì),馴化各自的降解菌,再將降解菌混合;2)以降解菌為主,外加功能細(xì)菌,例如,修復(fù)有機污染河流時可以加入光合細(xì)菌和硝化細(xì)菌;3)先馴化和分離出目標(biāo)污染物的降解菌,再馴化和篩選以其中間代謝產(chǎn)物或終產(chǎn)物為基質(zhì)的降解菌,再將菌株混合.例如,可單獨降解硝基苯的枯草芽苞桿菌和人蒼白桿菌在降解硝基苯時存在協(xié)同作用.Park等把能將3-氯硝基苯和4-氯硝基苯分別還原成5-氯-2-羥基乙酰苯胺和4-氯-2-羥基乙酰苯胺的PseudomonasputidaHS12菌株和能降解5-氯-2-羥基乙酰苯胺和4-氯-2-羥基乙酰苯胺的菌株Rhodococcussp.HS51共同培養(yǎng),在其它碳源存在的情況下,實現(xiàn)了3-氯硝基苯和4-氯硝基苯的礦化.例如,諾卡氏菌和假單胞菌生活在一起時,能降解環(huán)己烷,而各自單獨存在時,便無此能力.另外,具有協(xié)作關(guān)系的某兩個群體能共同產(chǎn)生一種酶,代謝某種底物,而單獨生活時,就不能合成這種酶.Pseudomonasstutzeri僅能把馬拉硫磷裂解成對硝基苯酚和二乙基硫磷酸,而不能進一步代謝這兩種中間產(chǎn)物,而Pseudomonasaeruginosa能礦化對硝基苯酚,但不能分解馬拉硫磷.當(dāng)這兩種菌生活在一起時,便可以很有效地降解馬拉硫磷.5微生物的正向趨化反應(yīng)細(xì)菌的趨化性是指運動細(xì)菌趨向某些化學(xué)吸引劑(正向趨化反應(yīng))或避開某些化學(xué)驅(qū)斥劑(負(fù)向趨化反應(yīng))的移動行為,這種現(xiàn)象是Engelmann于1883年發(fā)現(xiàn)的.有機污染物微生物降解的首要前提是降解細(xì)菌與其降解底物的直接接觸,而遠(yuǎn)離底物的細(xì)菌可以借助趨化反應(yīng)主動向底物靠近,因此微生物的正向趨化反應(yīng)在污染物的生物降解方面具有重要作用.Pseudomonassp.ZWL73菌株對4-CNB等12種化合物均表現(xiàn)出趨化性,而這些化合物大多能被用作ZWL73的生長底物,且趨化性是由降解質(zhì)粒所控制.Parales研究發(fā)現(xiàn),3種假單孢菌菌株對硝基苯甲酸鹽和氨基苯甲酸鹽產(chǎn)生趨化性.Sanmata等的研究表明,Ralstoniasp.SJ98只對能降解的硝基芳香族化合物NACs(nitro-aromaticcompounds)有趨化性,而對不能降解的NACs則無趨化性.目前,硝基苯類化合物的趨化性研究相對較少,主要是研究趨化性和降解性以及質(zhì)粒之間的關(guān)系,今后應(yīng)該進一步研究如何提高微生物的正向趨化能力,以便增強低濃度有機污染物污染環(huán)境的修復(fù)效果和加快修復(fù)速度.6微生物防治廢水隨著有毒化合物大量進入各種生態(tài)環(huán)境中,許多土著微生物能夠在原有的遺傳基礎(chǔ)上很快進化,降解很多過去被認(rèn)為是難以生物降解的物質(zhì),而編碼這些代謝活性的遺傳信息常常位于質(zhì)粒或染色體上.質(zhì)粒和染色體可以分別編碼某一化合物不同降解途徑的酶,互相補充,也可以單獨編碼.降解質(zhì)粒上的降解基因只能通過接合方式實現(xiàn)種內(nèi)或種間轉(zhuǎn)移.結(jié)合轉(zhuǎn)移可使不具備降解能力的菌株獲得降解能力,也可以組建多質(zhì)粒的新菌株和實現(xiàn)降解性質(zhì)粒DNA和染色體DNA的體外重組,構(gòu)建降解效率高、底物范圍廣、表達穩(wěn)定、比自然環(huán)境中的微生物更具競爭力的工程菌,從而開辟有機物降解的新途徑,實現(xiàn)難降解有機物的礦化.這一研究領(lǐng)域是生物技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境保護的研究熱點之一.PseudomonasC1S1菌株能通過氧化途徑脫除2,4,6-三硝基甲苯上的3個硝基,并將其作為生長的唯一氮源,但不能將甲苯作為唯一的碳源.將降解甲苯的Pseudomona的TOL質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至C1S1菌株中后,獲得了能同時脫除硝基和降解甲苯的轉(zhuǎn)移結(jié)合子,而獲得結(jié)合子的C1S1菌株能利用TNT為唯一的碳源、氮源和能源,并使硝基和甲苯徹底降解.Suen等在研究假單胞菌DNT菌株降解二硝基甲苯的氧化代謝途徑的基礎(chǔ)上,對其中3種加氧酶(二硝基甲苯雙加氧酶、4-甲基-5-硝基鄰苯二酚單加氧酶和2,4,5-三羥基甲苯加氧酶)的基因進行了克隆,并分析了這些基因的遺傳結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)分別在3個不同的操縱子上,利用含有這些基因的DNA片段,可檢測相似代謝途徑中的同源基因.Wu等鑒定了4-氯硝基苯和硝基苯降解菌株Comamonassp.CNB1降解質(zhì)粒pCNB1的兩個基因片斷cnbB-orf2-cnbA和cnbR-orf1-cnbCaCbDEFGHI,并克隆和表達了7個基因.結(jié)果表明,CnbA編碼硝基還原酶,CnbB編碼1-羥氨基苯變位酶,CnbCab編碼2-氨基酚1,6-雙加氧酶,CnbH編碼2-氨基-5-氯已二烯二酸脫氨酶.其中,CnbH編碼的脫氨酶可使4-氯硝基苯和硝基苯產(chǎn)生新的還原途徑.Hughes等克隆、測序和鑒定了PseudomonasputidastTW3DNA的6-kbp片斷,發(fā)現(xiàn)6-kbp包含5個基因,其中兩個編碼將4-硝基苯甲酸降解