樹豆木豆藥材質(zhì)量控制方法研究

樹豆木豆藥材質(zhì)量控制方法研究

甘薯是一種也被稱為“l(fā).”的科西嘉。它起源于印度支那半島，在云南、海南、廣東和臺灣等地廣泛種植。葉有抑菌消炎、清熱解毒、祛腐生肌等作用;國內(nèi)用含有木豆葉提取物的藥物治療股骨頭壞死取得了較好療效。樹豆葉主要含有l(wèi)ongistylinA,longistylinC等菧類(stilbenes)化合物,以及以牡荊苷、異美五針?biāo)呻p氫黃酮等黃酮類成分。LongistylinA和longistylinC是僅存在于Lonchocarpuslongistylus和樹豆等少數(shù)幾種豆科植物的特征化學(xué)成分。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究發(fā)現(xiàn),含有l(wèi)ongistylinA,longistylinC等菧類化合物的樹豆葉脂溶性部位具有顯著降低高脂模型小鼠體重、血清總甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)以及低密度脂蛋白膽固醇的水平,減少肝臟TG和TG蓄積等作用;國外學(xué)者報(bào)道longistylinA和longistylinC具有顯著的體外抗惡性瘧原蟲的作用。鑒于longistylinA,longistylinC是藥用植物樹豆的專屬性成分,又是藥材的藥物活性成分,值得將其作為藥材質(zhì)量控制的有效成分指標(biāo)。本文介紹了對longistylinA和longistylinC的分離鑒定,高效液相色譜(HPLC)技術(shù)建立含量測定方法,以及對不同產(chǎn)地藥材進(jìn)行檢測分析的結(jié)果。1儀器、試劑和儀器紫外光譜TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)測定;紅外光譜美國ANALECTRFX65A型光譜儀測定;質(zhì)譜API2000質(zhì)譜儀測定;核磁共振譜BrukerDRX-400儀測定,TMS為內(nèi)標(biāo)。Dionex高效液相色譜儀,P680輸液泵,UVD170U紫外檢測器,ASI-100自動(dòng)進(jìn)樣器,TCC-100柱溫箱,Chromeleon色譜工作站;BS224S電子分析天平(Sartorius);KQ3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司);硅膠TLC板、柱色譜硅膠(青島海洋化工廠);TLC顯色劑:3%香草醛-6%高氯酸溶液(取6%香草醛乙醇液與12%高氯酸水液等體積混合);甲醇為色譜純(Dikma公司,其他試劑均為分析純)。采集的樹豆樣品由植物學(xué)研究員李正紅鑒定為豆科植物C.cajan。2c-nmrc-1,c-3,5樹豆葉2.0kg用95%乙醇加熱回流提取3次,合并提取液,減壓回收乙醇,使殘留物混懸于水中,依次加石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯和正丁醇提取,各提取液減壓濃縮,得石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯和正丁醇部位。取二氯甲烷提取物行硅膠柱色譜,在硅膠TLC監(jiān)測下,依次用石油醚-丙酮(100∶0～50∶50,下同)洗脫,合并相同組成部分。在90∶10和80∶20洗脫部分分別析出粗晶,經(jīng)石油醚-二氯甲烷重結(jié)晶得1(3.06g)和2(0.32g)。化合物1C20H22O2;白色針狀結(jié)晶,易溶于氯仿、微溶于甲醇;與FeCl3反應(yīng)呈黃色。EI-MSm/z294(M+·),279,251,226,203,188,162,77。IRνKBrmax:3303,3057,3022,2959,2924,1630(w),1595,1461,1433cm-1。1H-NMR(CDCl3,400Hz)δ:7.47(2H,d,H-2′,6′,J=7.5Hz),7.35(2H,t,J=7.5Hz,H-3′,5′),7.26(1H,t,J=7.5Hz,H-4′),7.32,6.92(各1H,d,J=16Hz,H-7,8),6.68,6.36(各1H,d,J=2.5Hz,H-4,6),5.10(1H,t,J=7.0Hz,H-2″),4.87(1H,m,OH),3.78(3H,s,OCH3),3.41(2H,d,J=7Hz,H-1″),1.67,1.76(各3H,s,4″,5″-CH3);13C-NMR(CDCl3,100Hz)δ:137.5(C-1),121.1(C-2),158.5(C-3),98.5(C-4),154.3(C-5),104.1(C-6),123.4(C-7),127.9(C-8),137.9(C-1′),126.5(C-2′,C-6′),128.8(C-3′,C-5′),126.4(C-4′),24.1(C-1″),123.4(C-2″),130.9(C-3″),15.7(C-4″),17.9(C-5″),55.7(OMe)。化合物2C20H22O2;白色針狀結(jié)晶,易溶于氯仿、丙酮,微溶于甲醇;與FeCl3反應(yīng)呈黃色。MSm/z294(M+·),279,239,226,209,178,165,152,128,115,91,77。IRνKBrmaxmaxΚBr:3557,3022,2966,2924,2853,1581,1510,1454cm-1;1H-NMR(CDCl3,400Hz)δ:7.50(2H,d,J=7.5Hz,H-2′,6′),7.35(2H,t,J=7.5Hz,H-3′,5′),7.25(1H,t,J=7.5Hz,H-4′),7.04,7.00(各1H,d,J=16.5Hz,H-7,8),6.65,6.63(各1H,d,J=1.5Hz,H-2,6),5.29(1H,s,OH),5.24(1H,t,J=7Hz,H-2″),3.87(3H,s,OCH3),3.41(2H,d,J=7Hz,H-1″),1.81,1.74(各3H,s,4″,5″-CH3);13C-NMR(CDCl3,100Hz)δ:136.6(C-1),101.6(C-2),158.1(C-3),115.0(C-4),155.5(C-5),107.1(C-6),128.4(C-7),127.6(C-8),137.3(C-1′),126.5(C-2′,C-6′),128.7(C-3′,C-5′),128.7(C-4′),22.4(C-1″),121.9(C-2″),134.4(C-3″),25.8(C-4″),17.9(C-5″),55.8(OMe)?；衔?和2與樹豆中已分離出的單體longistylinC(2-異戊烯基-3-甲氧基-5-羥基菧)和longistylinA(4-異戊烯基-3-甲氧基-5-羥基菧)的光譜數(shù)據(jù)相一致,故分別鑒定為longistylinC和longistylinA。經(jīng)HPLC(面積歸一化法)測定,純度均為99%。3方法3.1對照溶液精密稱取2種對照品適量,加甲醇溶解并配制成0.1g·L-1的longistylinA與longistylinC對照品溶液。3.2對照品溶液的制備精密吸取longistylinA對照品溶液1mL,longistylinC對照品溶液2.5mL,加甲醇稀釋并定容至25mL,搖勻,即得(longistylinA0.004g·L-1,longistylinC0.010g·L-1)。3.3微孔濾膜的制備取樹豆樣品粉末(過40目篩)約0.4g,精密稱定,置100mL量瓶中,加甲醇約80mL,超聲30min,放冷,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,用微孔濾膜(0.45μm)濾過,即得。3.4流動(dòng)相溫度為甲醇-水,流動(dòng)相為柱溫,流動(dòng)相為2020ThermoBDSHypersilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動(dòng)相為甲醇-水(80∶20),檢測波長306nm,流速1mL·min-1,柱溫30℃。此條件下longistylinA與longistylinC分離度較好,并與其他組分達(dá)到基線分離,見圖1,理論塔板數(shù)不低于3000。3.5u3000日本標(biāo)準(zhǔn)曲線取3.2項(xiàng)下混標(biāo)溶液,進(jìn)樣1,2,4,8,10,12,14,16,20μL,測定,以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),對照品量(μg)為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別得longistylinA回歸方程Y=155.3X+0.1695,r=0.9998,longistylinA在0.00288～0.0576μg呈良好的線性關(guān)系;longistylinC回歸方程Y=81.615X+0.0766,r=0.9999,longistylinC在0.0112～0.224μg呈良好的線性關(guān)系。3.6精密度測試精密吸取對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,longistylinA和longistylinC峰面積的RSD分別為0.88%,1.1%。3.7質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定取4號藥材,按3.3項(xiàng)方法配制5份供試品溶液。進(jìn)樣測定,測得longistylinA和longistylinC平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.028%,0.27%,RSD為1.9%,2.2%。結(jié)果表明重復(fù)性良好。3.8比色穩(wěn)定性試驗(yàn)取4號藥材,按3.3項(xiàng)方法配制5份供試品溶液,分別于0,2,4,6,8,24h進(jìn)樣10μL,longistylinA和longistylinC峰面積的RSD分別為1.3%,2.7%,表明樣品中l(wèi)ongistylinA和longistylinC在24h內(nèi)穩(wěn)定。3.9加樣回收率取4號藥材,精密稱取9份,各0.2g,分別置100mL量瓶中,精密加入longistylinA對照品溶液(0.072g·L-1)0.20,0.25,0.30mL;longistylinC對照品溶液(0.532g·L-1)0.80,1.00,1.20mL,每個(gè)濃度3份;照3.3方法配制供試品液,進(jìn)樣10μL,計(jì)算加樣回收率,longistylinA和longistylinC平均回收率分別為98.9%,97.2%;RSD分別為2.4%,2.2%。3.10重量測定取不同產(chǎn)地的樹豆葉藥材,按3.3項(xiàng)方法配制供試品溶液(n=2),分別進(jìn)樣10μL,測定,結(jié)果見表1。4討論4.1色譜柱的選擇在同一色譜條件比較ECOSILC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)和ThermoBDSHypersilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)的分離效果,以ThermoBDSHYPERSILC18色譜柱對菧類成分longistylinA和longistylinC的分離度為佳。4.2流量相的選擇分別采用乙腈-水、甲醇-水作為流動(dòng)相進(jìn)行色譜分離,結(jié)果表明以甲醇-水(80∶20)的分離效果為佳。4.3測定藥材成分的定量質(zhì)量控制longistylinA和longistylinC對照品的流動(dòng)相溶液經(jīng)紫外-可見光全波長掃描,在306nm處有最大吸收,故選