土壤真菌基因組dna提取方法優(yōu)化及其多樣性和代表性分析

土壤真菌基因組dna提取方法優(yōu)化及其多樣性和代表性分析

1土壤微生物全基因組dna提取土壤真菌是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要成員。作為生物地球化學(xué)循環(huán)的重要參與者，它在碳、氮、磷、硫等養(yǎng)分循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。同時作為土壤生態(tài)系統(tǒng)外源有機(jī)污染物的重要分解者之一,在環(huán)境健康等方面發(fā)揮著重要作用。由于真菌組成與結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,到目前為止,自然土壤環(huán)境中大部分真菌尚不能人工分離培養(yǎng),自然棲息環(huán)境中150萬種真菌僅有5%～10%已被人類認(rèn)識(Bassam&Caetano-Anolles,1991;Hawksworth&Rossman,1997;Hawksworth,2001)。要客觀地揭示土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)組成、生態(tài)功能以及相互關(guān)系,最直接有效的方法是從土壤中提取全部微生物基因組DNA,并利用合適的分子生物學(xué)分析技術(shù),對其中真菌組成、變化及功能進(jìn)行研究(Ranjardetal.,2000;Lordetal.,2002;張漢波等,2003;Agnellietal.,2004;deLipthayetal.,2004;Kirketal.,2004)。因此,從土壤樣品中直接提取的真菌全基因組的質(zhì)量和代表性將影響到人們對土壤中真菌種群組成、結(jié)構(gòu)與豐度的認(rèn)識,建立適宜的土壤真菌全基因組DNA提取方法對開展土壤真菌分子生態(tài)學(xué)研究至關(guān)重要。土壤生態(tài)系統(tǒng)是化學(xué)組成最為復(fù)雜的系統(tǒng)之一,其中許多復(fù)雜組分,尤其是腐殖質(zhì)酸類物質(zhì),不僅影響提取的土壤微生物全基因組DNA質(zhì)量,同時也對后續(xù)PCR擴(kuò)增、雜交以及內(nèi)切酶消化等均將產(chǎn)生負(fù)面影響。由于真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特殊,含有大量幾丁質(zhì)以及多糖類物質(zhì),使得土壤真菌DNA的提取比細(xì)菌難度更大。同時,不同地域土壤的理化性質(zhì)有著很大差異,許多土壤基因組DNA提取方法能夠為土壤的微生物生態(tài)研究提供良好基礎(chǔ),但在另外一些土壤中的應(yīng)用卻受到了限制(Zhouetal.,1996;Krsek&Wellington,1999;Milleretal.,1999;Bürgmannetal.,2001;Martin-Laurentetal.,2001;Roose-Amsalegetal.,2001;Robeetal.,2003;Bertrandetal.,2005)。中國北方土壤腐殖質(zhì)酸含量較高,DNA提取相對困難,因此,本實驗針對真菌結(jié)構(gòu)特點,在傳統(tǒng)土壤微生物基因組DNA提取(Hurt,2001;Andersonetal.,2003;Brodieetal.,2003;Anderson&Cairney,2004)和純培養(yǎng)真菌DNA提取方法(Cenis,1992;李紹蘭等,2002)的基礎(chǔ)上,結(jié)合蝸牛酶、纖維素酶及溶菌酶等細(xì)胞裂解的常用酶制劑(尹睿等,2002),優(yōu)化了一種適合于北方土壤真菌全基因組DNA提取的有效方法,為開展北方土壤真菌分子生態(tài)學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。2材料和方法2.1蘑菇的來源和培養(yǎng)供試菌株見表1。所有供試菌株培養(yǎng)均采用PDA斜面培養(yǎng)基,于25℃培養(yǎng)4～5d。2.2土壤樣品的理化性質(zhì)分別采集中國科學(xué)院沈陽生態(tài)站、中國科學(xué)院長白山森林生態(tài)系統(tǒng)定位站和沈陽生態(tài)所烏蘭敖都荒漠化實驗站具有不同理化性質(zhì)的3種土壤樣品(表2)。土壤樣品以叉花點式采樣法采集,分別取5處表層0～20cm土壤樣品共10kg,充分混勻,過2mm篩后于-65℃保存?zhèn)溆谩?.3土樣的制備供試土壤采自中國科學(xué)院海倫農(nóng)業(yè)生態(tài)實驗站小麥-玉米-大豆輪作地表層0～20cm土層,稱取250g土樣,121℃,30min濕熱滅菌。取等量斜面培養(yǎng)收集到的菌體(表1)于無菌勻漿器中,混勻;加入少許無菌水,勻漿;無菌條件下將勻漿液加入250g滅菌黑土中,充分混勻后于-20℃保存?zhèn)溆谩?.4dna的提取分別收集少許培養(yǎng)皿中PDA培養(yǎng)基上生長的菌絲體于1.5mlEP管中,加入0.95ml提取緩沖液(100mmol·L-1EDTA+100mmol·L-1Tris+1.5mol·L-1NaCl,pH8.0),在旋渦混合器上振蕩混勻,再加入0.05ml20%的SDS使終濃度為1%,65℃水浴30min后,參考Zhou等(1996)的DNA提取方法,提取純菌DNA,溶解于TE(10mmol·L-1Tris+1mmol·L-1EDTA),并于-20℃保存?zhèn)溆谩?.5裂裂裂解應(yīng)用4種不同處理手段:1)液氮研磨;2)凍融(至-65℃冰箱中30min,-65℃水浴30min)3次;3)2%SDS,65℃裂解;4)纖維素酶、蝸牛酶和溶菌酶(終濃度分別為6、3和1mg·ml-1)37℃裂解(王衛(wèi)衛(wèi)等,2002),將其進(jìn)行不同組合,提取本實驗中制備的投菌土樣真菌全基因組DNA,并從中選出7種提取效果較好的方法,具體組合見表3。經(jīng)SDS裂解之后,土壤微生物裂解液采用Yeates等(1998)的方法進(jìn)行DNA抽提,提取到的DNA溶液于-20℃保存?zhèn)溆谩?.6土壤真菌dna的提取對于采集的3種自然土壤樣品均采用表3的方法5(凍融3次+酶解180min+SDS裂解60min)進(jìn)行土壤真菌全基因組DNA提取,所提取DNA溶液于-20℃保存?zhèn)溆谩?.7凝膠電泳dage用真菌通用引物U1/U2-GC(Sandhuetal.,1995)對純菌DNA以及土壤總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,目的產(chǎn)物為真菌28SrDNA上從403～662bp的一段260bp序列。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性3min;94℃變性1min,50℃退火40s,72℃延伸1min,35個循環(huán);最后72℃延伸10min。變性梯度凝膠電泳(DGGE)采用D-Codesystem(Bio-RadLaboratoriesInc,Hercules,CA,USA),8%聚丙烯酰胺凝膠,變性梯度為30%～70%(100%變性相當(dāng)于7mol·L-1尿素和40%去離子甲酰胺),PCR產(chǎn)物進(jìn)樣量為40μl。電泳在60℃,1×TAE(40mmol·L-1Tris,20mmol·L-1冰乙酸,1mmol·L-1Na2-EDTA),200V電壓條件下進(jìn)行5h(Krsek&Wellington,1999;Ranjardetal.,2000;Sigleretal.,2004)。電泳后,凝膠用SYBRGold染色或用改進(jìn)的Bassam和Caetano-Anolles(1991)銀染方法,染色膠片干燥后進(jìn)行掃描分析,封片保存。3結(jié)果與分析3.1不同方法所獲得dna的pcr-dage分析利用表3中的7種方法分別對真菌投菌土壤基因組DNA進(jìn)行提取,其DNA提取液濃度及DNA質(zhì)量見表4,瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖1。由表4和圖1可見,7種方法提取的DNA濃度各有差異,且質(zhì)量不同。其中方法4濃度最高,為12.2μg·g-1土,方法3濃度最低,為7.4μg·g-1土。從A260/A280和A260/A230比值分析,方法2所獲得的DNA提取液質(zhì)量最好,分別為1.74和1.53。從電泳圖譜分析,所有7種方法均可獲得片段大小接近的DNA條帶,且均大于19kb。這些片段明顯大于一般土壤全基因組DNA片段(接近于20kb),可能是因為本試驗中所用投菌土壤為滅菌土壤中僅加入真菌菌絲體,而真菌等真核微生物基因組比細(xì)菌等原核微生物基因組大得多。對上述7種方法所獲得的投菌土壤DNA進(jìn)行真菌特異性引物PCR,其擴(kuò)增產(chǎn)物DGGE圖譜見圖2。由圖2可知,方法1和方法5所獲得的真菌全基因組DNA樣品經(jīng)PCR-DGGE后所得到的條帶數(shù)量最多,顯示出較好的真菌種群的代表性。其中方法7實際上為Zhou等(1996)所采用的提取土壤中革蘭氏陽性菌基因組DNA的經(jīng)典方法,由于它在土壤環(huán)境樣品微生物全基因組DNA提取中的有效性而一直被廣泛應(yīng)用。但是,圖2表明,利用該方法提取土壤真菌時所獲得的DGGE條帶數(shù)在所有7種提取方法中最少,表明該方法在分析土壤真菌種群多樣性和代表性方面并不理想。由于方法5比方法1易于操作,因此,本文在進(jìn)行3種自然土壤真菌全基因組DNA提取與多樣性分析時均采用方法5。3.2pcr-dage圖譜本文采取PCR-DGGE方法分別對所選擇的12種真菌純培養(yǎng)物基因組DNA進(jìn)行分析。另外,利用方法5對3種不同來源的自然土樣以及投菌土樣進(jìn)行DNA提取,并利用真菌特異性引物進(jìn)行PCR-DGGE分析,其結(jié)果見圖3。利用真菌通用引物U1/U2-GC分別對12種不同純培養(yǎng)真菌基因組DNAPCR-DGGE結(jié)果顯示,除了泳道3(粒狀青霉)、泳道6(繩狀青霉)和泳道10(黃柄曲霉)以及泳道4(小可銀漢霉)和泳道7(卷枝毛霉)之間分別擁有相同條帶類型外,不同真菌均擁有各自特征性條帶,并且大部分真菌擁有2～3個不同拷貝數(shù)。投菌土樣的泳道共計有17條帶,涵蓋了所有純培養(yǎng)真菌的特征性條帶類型,證明利用本實驗中的方法5可獲得所有12種被投加到滅菌土壤中的真菌,利用該方法提取的土壤全基因組DNA具有較好的真菌組成代表性。泳道14～16分別為3種不同來源,具有不同理化性質(zhì)的土壤樣品全基因組DNA-PCR-DGGE圖譜。土壤等環(huán)境樣品DNA的提取除受所采用的提取方法制約外,其本身的理化性質(zhì)對DNA提取的效率和質(zhì)量也有很大影響。一般來說,土壤中有機(jī)質(zhì)含量越高,所提DNA的產(chǎn)量越大,質(zhì)量越差;土壤中粘粒比例越高,則DNA的純度越低(張瑞福等,2003)。在本實驗3種自然土壤樣品中,長白山暗棕壤所提取的DNA顯淡棕色,而其它2種土壤所提取DNA為無色,與文獻(xiàn)報道相一致(Zhouetal.,1996;楊瑞馥,2000;張瑞福等,2003)。從圖3可見,3種自然土樣PCR-DGGE圖譜條帶豐富,說明利用本實驗所建立的土壤真菌全基因組DNA提取方法5進(jìn)行土壤真菌多樣性研究時,土壤的理化性質(zhì)對分析其真菌組成影響并不明顯。4土壤真菌dna的提取和多樣性分析土壤真菌DNA提取一直是真菌分子生態(tài)學(xué)研究所面臨的難題。一般土壤總DNA提取中所用到的溶菌酶對真菌細(xì)胞壁作用極小,而蝸牛酶和纖維素酶常用于真菌原生質(zhì)體的制備,可以有效地分解真菌細(xì)胞壁。本實驗在傳統(tǒng)土壤總DNA提取方法優(yōu)化的基礎(chǔ)上引入蝸牛酶和纖維素酶對真菌細(xì)胞壁的分解作用,通過所建立的含有12種不同真菌的混菌土壤樣品模型比較了7種不同的土壤真菌全基因組DNA提取方法,并對其DNA片段大小、產(chǎn)量、質(zhì)量