Chapter-1-高效液相色譜法原理解析

沃特世科技〔上?！?/p>

地址：上海市浦東新區(qū)張東路1387號41棟熊鶯客戶培訓(xùn)師Mail:HPLC根底液相原理名目歷史色譜法原理液相色譜系統(tǒng)HPLC參數(shù)與術(shù)語分別度公式固定相與物理性質(zhì)了解范氏方程色譜柱色譜的定義是一種分別科學(xué)在液相或氣相中使化合物到達(dá)分子水平的分別Chromato--顏色Graphy--圖像首先在俄國科學(xué)家Tswett(茨維特)的試驗中進(jìn)展了描述樣品－植物提取物他將植物色素的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣的直立玻璃管，再參與石油醚使其自由流下，結(jié)果色素中各組份相互分別形成各種不同顏色的譜帶化合物得以分別色譜法簡介色譜法〔Chromatography〕溯源100多年前俄國植物學(xué)家Tswett〔茨維特〕分別植物色素時承受的試驗方法Tswett用希臘語chroma〔色〕和graphos〔譜〕描述他的試驗方法，即現(xiàn)在的Chromatography〔色譜法〕Tswett的色譜系統(tǒng)色譜進(jìn)展史回憶1903－1906Tswett首次使用這套色譜系統(tǒng)1930－1932Karrer,Kuhn和Strain用氧化鈣、氧化鋁和氧化鐵做吸附劑1941Martin和Synge引入了柱分別色譜1944Gonsden,Gorrdon和Mardin介紹了紙分別色譜1951Kirchner引入了我們現(xiàn)在仍在使用的TLC1952James和Martin進(jìn)展了氣相色譜1964進(jìn)展了現(xiàn)在仍在使用的凝膠滲透色譜〔GPC〕1968高效液相色譜消逝了色譜法簡介色譜法的原理是利用混合物中各組份在不同的兩相中溶解，安排，吸附等化學(xué)作用性能的差異，當(dāng)兩相作相對運(yùn)動時，使各組分在兩相中反復(fù)屢次受到上述各作用力而到達(dá)相互分別。兩相中有一相是固定的，叫作固定相(StationaryPhase)，有一相是流淌的，稱為流淌相(MobilePhase)，流淌相又叫洗脫劑,溶劑。相〔Phase〕：物理化學(xué)術(shù)語，特指在某一系統(tǒng)中，具有一樣成分及一樣物理、化學(xué)性質(zhì)的均勻物質(zhì)局部。各相之間有明顯可分的界面。色譜法原理色譜法原理分別是一個物理過程。固定相(StationaryPhase)流淌相(MobilePhase)進(jìn)樣(Injection)洗脫(Elution)相互作用(Interaction)依據(jù)分子量區(qū)分的色譜類型氣相色譜液相色譜吸附/分別液相色譜離子交換體積排解色譜凝膠滲透/凝膠過濾HPLC的系統(tǒng)

溶劑(流動相)

泵進(jìn)樣器

色譜柱(固定相)檢測器廢液數(shù)據(jù)系統(tǒng)什么是色譜圖？色譜圖〔Chromatogram〕：色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間的曲線圖，其縱坐標(biāo)為信號強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為時間←色譜峰時間(分)基線↓峰高峰寬響應(yīng)值術(shù)語–流淌相在HPLC中流淌相是液體全部要分析的樣品必需能溶解在流淌相中帶著樣品與固定相做相對運(yùn)動術(shù)語–固定相色譜填料－它在色譜柱里處于固定位置執(zhí)行化學(xué)分別也被稱為色譜填料或吸附劑固定相與流淌相固定相與流淌相具有相反的性質(zhì)，正是由于這種性質(zhì)的差異使他們對所分析的化合物具有競爭性液相色譜圖名詞術(shù)語(1)色譜圖名詞術(shù)語:色譜峰(Peak):色譜柱流出組分通過檢測器時產(chǎn)生的響應(yīng)信號峰底(PeakBase):峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間連接的直線峰高(PeakHeight):峰最大值到峰底的距離切線峰寬(PeakWidth):在峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作切線與峰底相交兩點(diǎn)之間的距離半(高)峰寬(PeakWidthatHalfHeight):通過峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線,其與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離液相色譜圖名詞術(shù)語(2)色譜圖名詞術(shù)語:峰面積(PeakArea):峰與峰底之間的面積,又稱響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差(σ)(StandardError):0.607倍峰高對應(yīng)峰寬的一半拖尾峰(TailingPeak):后沿較前沿平緩的不對稱峰前伸峰(LeadingPeak):前沿較后沿平緩的不對稱峰鬼峰(GhostPeak):并非由試樣所產(chǎn)生的峰,亦稱假峰液相色譜圖名詞術(shù)語(3)色譜圖名詞術(shù)語:基線(Baseline):在正常操作條件下,僅由流淌相所產(chǎn)生的響應(yīng)信號基線飄移(BaselineDrift):基線隨時間定向的緩慢變化基線噪聲(N)(BaselineNoise):由各種因素所引起的基線波動譜帶擴(kuò)展(BandBroadening):由于縱向集中,傳質(zhì)阻力等因素的影響,使組分在色譜柱內(nèi)移動過程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象色譜參數(shù)V-保存體積V0-死體積tr-保存時間k’–保存因子或容量因子-選擇或分別因子N–塔板數(shù)w-峰寬R–分別度洗脫體積和峰寬這些是導(dǎo)出理論和定義所必需的根本測量V0=無保存化合物的洗脫體積,等于一個柱體積V1=化合物1的洗脫體積V2=化合物2的洗脫體積W2=化合物2的峰寬(以體積計)，用切線法計算容量因子〔保存因子，k’〕：保存力氣的量度k

是樣品與填料作用強(qiáng)度的直接量度

V0V1

V2V3

時間.5125描述了峰距離V0有多遠(yuǎn)與流速、時間和柱子尺寸無關(guān)容量因子k’k’與組分在流淌相和固定相之間的平衡有關(guān)k’是一個平衡常數(shù)在正相與反相色譜中的容量因子k’容量因子的大小取決于流淌相和固定相的極性可以通過轉(zhuǎn)變流淌相中有機(jī)相的比例來轉(zhuǎn)變流淌相的極性只適用于吸附和安排色譜通過轉(zhuǎn)變流淌相的極性轉(zhuǎn)變k’分別因子〔選擇因子，〕：峰分別程度的量度

V0V1

V2V3

時間.5125

1,2

1,3相鄰兩個峰k’值的比值描述的兩個峰的相對位置取決于系統(tǒng)的“化學(xué)”屬性α是兩個化合物在同一套色譜系統(tǒng)上保存差異的數(shù)值表述分別因子〔〕的影響因素－流淌相取決于流淌相的“化學(xué)”性質(zhì)，即選擇不同的有機(jī)相分別因子〔〕－固定相分別度〔R〕的定義式簡潔說來,分別度即是兩峰相對于其峰寬分開得有多遠(yuǎn)R:分別程度的量度此處是幾個計算分別度的實(shí)例

t0t1

t2t3時間.5125理論塔板數(shù)〔N〕：柱效的量度理論塔板數(shù)計算公式：

W σ

方法

Wtan 16 切線法

Wh 5.54 半峰高W3σ 9 3σW4σ

16

4σW5σ

25

5σ理論塔板數(shù)〔N〕:分別效率的量度理論塔板數(shù)或柱效是一個數(shù)值,它表示作為保存時間函數(shù)的峰展寬的量度PW=.5PW=2柱效的計算－5σ方法用HETP表示柱效H=HETP(HeightEquivalenttoTheoreticalPlate){要求H盡可能小,這樣就可以往柱子里‘裝’更多的‘板’}N=#Plates(來自蒸餾理論)

5塊板 10塊板(較大的H)(較小的H)“較厚” “較薄”L

柱長PlateHETP分別度方程式分離因子柱效容量因子分別度方程式描述了分別度與選擇性,柱效和容量因子之間的關(guān)系它是評價一張色譜圖以及準(zhǔn)備如何解決、開發(fā)和優(yōu)化分別方法的依據(jù)分別度方程式假設(shè)N增加2倍或3倍，R會怎樣？N對分別度〔R〕的影響分別度方程式假設(shè)k=1,2，10，20分別度分別是多少？k’對分別度的影響分別度方程式假設(shè)＝1或1.4分別度分別是多少？對分別度的影響，k’，N:如何把握分別度?原始分別狀況轉(zhuǎn)變k’轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)變N固定相－物理性質(zhì)柱材料顆粒外形粒徑VanDeemter曲線孔徑柱體積柱材料不銹鋼玻璃塑料HDPE(HighDensityPolyethylene)PEEK(Polyetheretherketone)色譜柱實(shí)例色譜柱構(gòu)造固定相篩板色譜柱的裝填篩板球形顆粒無定形顆粒填充床(固定相)填充色譜柱的流動方向規(guī)章/球形粒徑/不規(guī)章粒徑填充材料的外形制造顆粒技術(shù) 最新 原始的柱效 最高 良柱床穩(wěn)定性 最好 好柱填充材料和類型石英〔無機(jī)〕二氧化硅與海砂相像鋁〔無機(jī)〕氧化鋁鋯〔無機(jī)〕聚合物〔有機(jī)〕塑料雜化〔無機(jī)/有機(jī)〕碳1um=10-6m分析柱一般2.5-5um〔10um〕粒徑越小，柱效越高！填料的粒徑粒徑分布目前常用粒徑范圍例如：5um(3um－7um)粒徑分布范圍窄，柱效高，但是本錢高3 5 7456微米HPLC常用顆粒色譜硅膠是目前為止最常用的HPLC顆粒很多公司生產(chǎn)很多種類的以硅膠為根底的填充才來色譜的柱效歸根結(jié)底是由顆粒的生產(chǎn)工藝準(zhǔn)備的顆粒的外表性質(zhì)大外表積顆粒是全多孔色譜吸附劑高柱效的關(guān)鍵多孔顆?！差愃朴诤Ｃ蘩锏目住晨椎拇笮∫栽哟笮閱挝?，Angstroms〔10-10m〕經(jīng)典的分析型填料顆粒的粒徑范圍為60-125顆粒的多孔性－以海綿為例多孔性與大外表積的比較有很多小孔60-125高外表積300-500m2/g適用于小分子和藥物的分析 很少的一些大孔250-4,000低的外表積50-150m2/g適用于大分子和蛋白的分析顆粒的外表積顆粒外表積：m2/g固體的硅膠球體5m2/g色譜硅膠300m2/g足球場=6500m2≈22g理論塔板數(shù)vs柱效每根柱子都有自己特殊的曲線，取決于不同的尺寸和粒徑只有一個流速可得到最大柱效優(yōu)化的范第姆特〔vanDeemter〕方程范第姆特〔vanDeemter〕方程能夠推導(dǎo)出流淌相的線速度對給定峰的理論板高〔H〕的影響其中:A項:叫作渦流擴(kuò)散項,與填料的顆粒度及其分布和填充技術(shù)相關(guān)B項:叫作軸向(縱向)擴(kuò)散項,與流速有關(guān)C項:叫作傳質(zhì)阻力項,與填料顆粒度和流速有關(guān)HETP=HeightEquivalenttoaTheoreticalPlate)=柱長/塔板數(shù)=L/N

流淌相的線速度－u經(jīng)典的定義：u0=L/L0其中：L-柱長，u0–沒有保存化合物的洗脫時間被分析物譜帶和vanDeemterA項XXXX譜帶擴(kuò)散樣品分子填料溶劑XX柱內(nèi)的不同流路可用來通過分子. 被分析物譜帶展寬較小顆?？梢匝b填得更致密

削減孔隙通道間的空間

削減譜帶展寬渦流集中顆粒尺寸

A項H

柱效空隙體積或通道被分析物譜帶和vanDeemterB項-軸向集中BB較慢的線速度u,(或流速),更大的軸向譜帶擴(kuò)散=>寬峰==>更大的“B”項較高的線速度u,譜帶軸向擴(kuò)散的時間減少

=>較尖銳的峰==>小的“B”項uB項H

柱效（譜帶擴(kuò)散）被分析物譜帶和vanDeemterC項傳質(zhì)阻力項C項由三局部奉獻(xiàn)組成:流淌相流淌時的傳質(zhì)阻力

流淌相停滯時的傳質(zhì)阻力固定相的傳質(zhì)阻力〔吸附/解吸動力學(xué)〕XXX譜帶展寬XXXXXX譜帶展寬XX譜帶展寬樣品/組分帶與vanDeemter方程C項-傳質(zhì)阻力項其中： Dm-流淌相的集中相關(guān)系數(shù) Dsm-流淌相的停滯集中系數(shù) Ds-固定相的集中系數(shù) dp–粒徑 df–固定相膜厚度Cm,Csm,Cs是常數(shù)H=A++CuBuu

C項H

柱效uC項

H

柱效VanDeemter曲線注：假設(shè)線速度〔流速〕超過了最正確線速度，則HETP增加，塔板數(shù)降低線速度

HETP低HETP=>優(yōu)化的塔板數(shù){mm/sec}

C項(質(zhì)量傳遞)B項(軸向擴(kuò)散)C項B項VanDeemter曲線－減小粒徑粒徑減小，柱效增加隨著粒徑減小，保持高柱效的流速范圍擴(kuò)大為同