核酸的酶促降解和核苷酸代謝-核苷酸的生物合成

第十四章核酸的生物合成教學(xué)基本要求1.生物體內(nèi)遺傳信息是如何進(jìn)行傳遞的?2.DNA的生物合成主要分為哪幾個階段?需要哪些酶的參與，這些酶具有哪些重要特點？3.DNA的生物合成具有哪些重要特點？4.什么是逆轉(zhuǎn)錄？基本過程如何？5.什么是轉(zhuǎn)錄作用？轉(zhuǎn)錄作用分為哪幾個階段？轉(zhuǎn)錄作用與DNA生物合成相比具有哪些異同點？6.什么是RNA的合成后加工？主要包括哪些變化？7.什么是半保留復(fù)制、半不連續(xù)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄？蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA生物的遺傳信息以密碼的形式儲存在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序。在細(xì)胞分裂的過程中，通過DNA復(fù)制把親代細(xì)胞所含的遺傳信息忠實地傳遞給兩個子代細(xì)胞。在子代細(xì)胞的生長發(fā)育過程中，這些遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄傳遞給RNA，再由RNA通過翻譯轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的蛋白質(zhì)多肽鏈上的氨基酸排列順序，由蛋白質(zhì)執(zhí)行各種各樣的生物學(xué)功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳特征。遺傳信息傳遞的中心法則

后來人們又發(fā)現(xiàn)，在宿主細(xì)胞中一些RNA病毒能以自己的RNA為模板復(fù)制出新的病毒RNA，還有一些RNA病毒能以其RNA為模板合成DNA，稱為逆轉(zhuǎn)錄這是中心法則的補(bǔ)充。中心法則總結(jié)了生物體內(nèi)遺傳信息的流動規(guī)律，揭示遺傳的分子基礎(chǔ)，不僅使人們對細(xì)胞的生長、發(fā)育、遺傳、變異等生命現(xiàn)象有了更深刻的認(rèn)識，而且以這方面的理論和技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展了基因工程，給人類的生產(chǎn)和生活帶來了深刻的革命。二、DNA的生物合成（一）半保留復(fù)制

DNA分子是生物體內(nèi)遺傳信息的原初載體，在其合成中所需要的信息只能來自于自身，即本身的結(jié)構(gòu)。

15NH4144CI圖9-2DNA復(fù)制方式假說1958年用Meselson–Stahl用實驗的方法首次證明了DNA的半保留復(fù)制方式。E.Coli15NH4CI培養(yǎng)多代14NH4CI培養(yǎng)圖9-3密度梯度離心法示意圖。分離DNA，密度離心法測定DNA的密度。14N-15N15N14N14N-15N14N14N14N-15N圖9-4Meselson–Stahl實驗結(jié)果及解釋半保留復(fù)制的生物學(xué)意義：由于在新合成的雙鏈DNA中總有一條鏈來自于親代，有利于維持遺傳物質(zhì)的相對穩(wěn)定。

（二）DNA復(fù)制的起點和方式DNA分子中能夠進(jìn)行獨立復(fù)制的單位稱為復(fù)制子（replicon）。每個復(fù)制子都含有控制復(fù)制的起點（origin）和終點（terminus）,DNA復(fù)制的控制是在起始階段進(jìn)行的，一旦復(fù)制開始，它將一直進(jìn)行到底。（1）單向、雙向復(fù)制

a.雙向復(fù)制（bidirectional），向起點的兩側(cè)進(jìn)行復(fù)制，形成兩個復(fù)制叉或兩個生長點。

b.單向復(fù)制（unidirectional）,向起點的一側(cè)進(jìn)行復(fù)制，形成一個復(fù)制叉或兩個生長點。

圖9-6DNA復(fù)制的方式（單向復(fù)制、雙向復(fù)制）

DNA復(fù)制有些是對稱的，兩條鏈以相同的速率同時進(jìn)行復(fù)制，也有不對稱的，一條鏈開始復(fù)制一段時間后再開始另一條鏈的復(fù)制。（2）復(fù)制方式不同生物DNA復(fù)制的方式有較大不同，尤其是低等生物，概括起來包括直線雙向、多點雙向、形雙向、形單向、滾動環(huán)、D-環(huán)及2D環(huán)七種類型。圖9-7DNA復(fù)制的不同方式示意圖（一）圖9-8DNA復(fù)制的不同方式示意圖（二）

（三）參與DNA復(fù)制的酶和蛋白因子

1.DNA聚合酶（DNAPolymerase）

（1）原核細(xì)胞中的DNA聚合酶①DNA聚合酶IKornberg于1956年在E.coli中發(fā)現(xiàn)的，M.W109000，一條多肽，1000AA組成，活性部位有一個Zn2+,是一個多功能酶。

a5′3′聚合酶活性

按照模板DNA所規(guī)定的核苷酸順序，將其通過5′，3′磷酸二酯鍵彼此連接起來的酶活性。

b5′3′外切酶活性（引物切除）

c3′5′外切酶活性（校正功能）功能：參與DNA復(fù)制及DNA的損傷修復(fù)特性DDDPIDDDPIIDDDPIII5′3′的聚合酶活性5′3′的外切酶活性3′5′的外切酶活性每個細(xì)胞中分子數(shù)酶相對活力功能+++4001000復(fù)制、修復(fù)+-+10050損傷修復(fù)+-+1050000延長作用DDDPI、DDDPII、DDDPIII特性比較DNA聚合酶Ⅲ全酶

核心酶PolIII

PolIII延長因子DNA聚合酶Ⅲ二聚體圖9-11DNA聚合酶III

滑動夾子結(jié)構(gòu)(a)末端俯視圖(b)側(cè)視圖（2）真核細(xì)胞中的DDDP

真核細(xì)胞中的DDDP共有四種，分別是DDDP、DDDP、DDDP、DDDP

。DDDPDNA復(fù)制期活性最高，可能與DNA復(fù)制有關(guān)

DDDP

細(xì)胞各時期變化不大，與DNA的損傷修復(fù)有關(guān)

DDDP

與線粒體DNA復(fù)制有關(guān)

DDDP

功能仍不太清楚真核細(xì)胞中的DDDP一般沒有3′5′的外切酶活性，因此推測可能有專門的酶完成校正作用。

2.引物酶和引物體

E.coli的引物酶由一條多肽鏈構(gòu)成，60KD，單獨存在是沒有作用，只有與DnaB、DnaC、DnaT等蛋白組成一個復(fù)合體時，才能催化小分子RNA的合成，其中，DnaB與起始位點的識別有關(guān)。

3.DNA連接酶

DNA連接酶是將一個DNA單鏈的5′-磷酸基團(tuán)與另一個DNA單鏈的3′-OH端以3，5-磷酸二酯鍵相連接起來的一種酶。DNA的連接是一個耗能反應(yīng)。真核細(xì)胞由ATP供能，原核細(xì)胞由NAD+供能。

圖9-12DNA連接酶作用示意圖功能（1）參加DNA損傷修復(fù)，將斷開的DNA單鏈重新連接起來；（2）參加DNA復(fù)制，將新合成的DNA片段連接起來形成完整的DNA單鏈；（3）線狀DNA首尾相接形成環(huán)狀DNA。

4.解鏈酶(DNA解螺旋酶)解鏈酶是在消耗ATP的條件下，將雙鏈DNA解開形成單鏈的酶類。E.coli中的解鏈酶有兩類，一類結(jié)合在滯后鏈的模板上，沿5′→3′方向移動，另一類結(jié)合在前導(dǎo)鏈的模板鏈上，沿3′→5′方向移動。

5.DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNA旋轉(zhuǎn)酶）

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是一類負(fù)責(zé)將超螺旋DNA變成松弛態(tài)DNA或其逆向變化的一類酶。該類酶同時具有內(nèi)切酶及連接酶功能。

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I通過將一條DNA雙鏈中的一條鏈切斷，使其繞另一條鏈旋轉(zhuǎn)，然后重新連接起來的方式，將超螺旋解除。該酶也可以在由ATP供能的條件下，將雙螺旋變成超螺旋。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II負(fù)責(zé)將完成復(fù)制后成互鎖狀的兩個環(huán)狀DNA相互解開（同時斷開雙鏈）。

6.單鏈結(jié)合蛋白（SSB）:結(jié)合在解開的DNA單鏈上，防止重新形成雙螺旋。圖9-13DNA拓樸異構(gòu)酶作用示意圖解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物

(四)原核生物DNA的復(fù)制過程

n1dATP+n2dGTP+n3dCTP+n4dTTPDNA+(n1+n2+n3+n4)PPiDNA聚合酶DNA模板、Mg2+

DNA單鏈模板、引物合成酶、DNA聚合酶、連接酶等多種酶或蛋白質(zhì)因子的參與。

DNA的復(fù)制過程包括起始、延長、終止三個階段。⑴起始

a.起始位點的結(jié)構(gòu)大腸桿菌DNA復(fù)制的起點稱為oriC，由245個堿基構(gòu)成，關(guān)鍵是兩組短的重復(fù)序列，這些序列在細(xì)菌中高度保守。b.起始的過程

DNA復(fù)制開始時，大約20-40個DnaA蛋白各自攜帶一個ATP結(jié)合在起始位點處，并聚集在一起，DNA纏繞其上形成起始復(fù)合物。HU是細(xì)胞類組蛋白，可與DNA鏈結(jié)合，促使雙鏈DNA彎曲，受其影響，鄰近三組富含AT的序列變性，形成開鏈復(fù)合物，隨后DnaB六聚體在DnaC蛋白的幫助下，結(jié)合于解鏈區(qū)，并沿DNA鏈的5′-3′方向移動，形成前引發(fā)復(fù)合物。圖9-14DNA復(fù)制的起始過程示意圖⑵延長

DNA復(fù)制中與延長有關(guān)的酶主要有三種：DNA拓樸異構(gòu)酶使超螺旋變成雙螺旋，DNA解螺旋酶（解鏈酶）雙鏈DNA解鏈形成局部單鏈，SSB蛋白穩(wěn)定解開的DNA單鏈。DNA前導(dǎo)鏈的合成開始于由引物酶合成的一段RNA小片段，在DNA聚合酶III的催化下，按照從5′→3′的方向，將與模板DNA對應(yīng)的脫氧核苷酸不斷加到引物RNA或前面合成的DNA片段的3′-OH上，直到合成結(jié)束。

隨后鏈的合成是以合成岡崎片段的方式完成的，首先合成RNA引物，隨后在DNA聚合酶III的催化下，將脫氧核苷酸依次以3，5-磷酸二酯鍵的形式連接到RNA引物或前面合成的DNA片段的3′-OH，使其不斷延長。

半不連續(xù)復(fù)制、前導(dǎo)鏈、隨后鏈、岡崎片段DNA雙鏈在復(fù)制時，雙鏈解開，每一條鏈各自作為一個模板進(jìn)行DNA的復(fù)制，其中，沿3′→5′模板鏈合成的DNA單鏈?zhǔn)前凑者B續(xù)的方式合成，而沿5′→3′模板鏈合成的DNA單鏈則是按照不連續(xù)的方式合成的，這種復(fù)制方式稱為半不連續(xù)復(fù)制。

DNA復(fù)制中，以連續(xù)方式合成的DNA單鏈稱前導(dǎo)鏈（領(lǐng)頭鏈）；按不連續(xù)方式合成的DNA單鏈稱隨后鏈（滯后鏈）；在隨后鏈合成中依次合成的核酸小片段稱岡奇片段。圖9-9DNA復(fù)制叉及半不連續(xù)復(fù)制示意圖圖9-15DNA復(fù)制的延長作用圖9-16前導(dǎo)鏈和隨后鏈的合成⑶終止當(dāng)后面一個DNA片段的合成進(jìn)行到與它前面的一個岡崎片段的RNA引物相接時，延長作用停止。①DDDPI引物切除。②DDDPI聚合酶活性填補(bǔ)缺口。③DNA連接酶將DNA片段連接起來，形成完整的DNA分子。DNAreplicatAnimation圖9-17

DNA復(fù)制的終止過程復(fù)制的忠實性

DNA復(fù)制過程是一個高度精確的過程，據(jù)估計，大腸桿菌DNA復(fù)制109-1010堿基對僅出現(xiàn)一個誤差，保證復(fù)制忠實性的原因主要有以下三點:a、DNA聚合酶的高度專一性（嚴(yán)格遵循堿基配對原則）b、DNA聚合酶的校對功能（錯配堿基被3’-5’

外切酶切除）c、起始時以RNA作為引物真核細(xì)胞DNA復(fù)制的特點

多個起點復(fù)制起點起點起點起點起點起點

端粒（telemere）復(fù)制端粒酶（telomerase）

DNA復(fù)制需要引物，但在線形DNA分子末端不可能通過正常的機(jī)制在引物被降解后合成相應(yīng)的片段.如果沒有特殊的機(jī)制合成末端序列，染色體就會在細(xì)胞傳代中變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得到了澄清，端粒酶是一種含RNA的蛋白復(fù)合物，實質(zhì)上是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，它能催化互補(bǔ)于RNA模板的DNA片段的合成，使復(fù)制以后的線形DNA分子的末端保持不變。

初步研究表明，人體中生殖細(xì)胞的端粒長度保持不變，而體細(xì)胞的端粒長度則隨個體的老化而逐步縮短。對此的一個推論是：人的生殖細(xì)胞具端粒酶的活力，體細(xì)胞則否。這一問題的解決無疑會有助于對生命衰老的認(rèn)識。5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒合成的一種模型3′5′TTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3′5′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3′5′AATTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和雜交移位和再雜交端粒合成的完成TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTT5′3′nAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTCCCCTnAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTn進(jìn)一步加工繼續(xù)延伸真核和原核DNA細(xì)胞復(fù)制比較六、

反轉(zhuǎn)錄作用1、概念2、反轉(zhuǎn)錄酶3、病毒逆轉(zhuǎn)錄過程4、反轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)意義擴(kuò)充了中心法則有助于對病毒致癌機(jī)制的了解與真核細(xì)胞分裂和胚胎發(fā)育有關(guān)逆轉(zhuǎn)錄酶是分子生物學(xué)重要工具酶三種功能依賴DNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶活力依賴RNA的DNA聚合酶活力核糖核酸酶H活力

以RNA為模板合成DNA，這與通常轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息從DNA到RNA的方向相反，故稱為逆轉(zhuǎn)錄作用。逆轉(zhuǎn)錄過程中cDNA的合成

依賴RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力依賴DNA的DNA聚合酶逆逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期RNA衣殼被膜逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯整合入宿主細(xì)胞染色體DNA進(jìn)入細(xì)胞丟失被膜丟失衣殼逆轉(zhuǎn)錄RNARNAcDNA衣殼蛋白被膜蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶（七）DNA損傷與修復(fù)由于受紫外線輻射、電離輻射等物理因素及亞硝酸、羥胺、烷化劑等化學(xué)因素的影響，DNA分子的核苷酸組成或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這種現(xiàn)象稱為DNA的損傷。突變的類型：（1）轉(zhuǎn)換（2）顛換（3）插入（4）缺失

DNA損傷的修復(fù)方式有光復(fù)活、切除修復(fù)、重組修復(fù)及SOS修復(fù)。1.光復(fù)活修復(fù)光復(fù)活修復(fù)系統(tǒng)是生物體內(nèi)專一性修復(fù)紫外線造成的嘧啶二聚體損傷的一種修復(fù)機(jī)制。光復(fù)活酶可以自發(fā)地尋找到損傷部位，并與之結(jié)合，隨后利用光的能量，將嘧啶二聚體損傷部位修復(fù)。DNA紫外線損傷的光裂合酶修復(fù)1、形成嘧啶二聚體2、光復(fù)合酶結(jié)合于損傷部位3、酶被可見光激活4、修復(fù)后酶被釋放DNA的損傷和切除修復(fù)堿基丟失堿基缺陷或錯配結(jié)構(gòu)缺陷切開核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA連接酶AP核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切開切除修復(fù)連接糖苷酶插入酶堿基取代DNA的重組修復(fù)胸腺嘧啶二聚體復(fù)制核酸酶及重組蛋白修復(fù)復(fù)制DNA聚合酶DNA連接酶重組SOS反應(yīng)的機(jī)制靶基因表達(dá)lexA靶基因表達(dá)但產(chǎn)物被分解recA大量表達(dá)RecA促使分解LexA未誘導(dǎo)的細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞靶基因lexA基因被LexA

蛋白質(zhì)部分阻遏recA基因被LexA

蛋白質(zhì)部分阻遏（40個不同的位點被阻遏）LexA(阻遏物)

RecA(輔蛋白酶)單鏈DNAATP二、RNA的生物合成生物體內(nèi)RNA的生物合成根據(jù)模板及具體合成方式的不同分為轉(zhuǎn)錄和復(fù)制兩種方式。（一）DNA指導(dǎo)下的RNA的生物合成（轉(zhuǎn)錄作用）轉(zhuǎn)錄是指以DNA單鏈為模板合成RNA的化學(xué)過程。除極少數(shù)生物細(xì)胞之外，生物體的mRNA、tRNA、rRNA都是通過轉(zhuǎn)錄作用形成的。催化轉(zhuǎn)錄作用的酶稱為RNA聚合酶。n1ATP+n2GTP+n3CTP+n4UTPRNA+(n1+n2+n3+n4)PPi

RNA引物Mg2+

或Mn2+

RNA與DNA的生物合成有一些重要區(qū)別，主要表現(xiàn)在:（1）原料不同。（2）堿基配對方式不同。（3）模板不同，轉(zhuǎn)錄作用是以DNA雙鏈中某一條單鏈的某一個片段為模板進(jìn)行合成的，因此稱為不對稱轉(zhuǎn)錄，其中能夠指導(dǎo)RNA生物合成的DNA單鏈稱為無意義鏈（模板鏈），另外的一條鏈稱為有意義鏈（編碼鏈）。（4）催化反應(yīng)的酶不同。1.RNA聚合酶

E.coli的E，M.W480000-500000，在6M的脲中可以解離成、、′、及五種亞基。全酶由兩個亞基、一個亞基、一個′亞基、一個亞基及一個因子構(gòu)成，其中除因子外，其它五個亞基結(jié)合緊密稱為核心酶。

大腸桿菌RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)示意圖

核心酶(α2ββ

)起始因子β

——和模板DNA結(jié)合β——起始和催化聚合反應(yīng)α——？全酶(αββ

)研究結(jié)果表明，RNA聚合酶中每種亞基均有其特殊功能。

-因子與轉(zhuǎn)錄啟始位點的識別有關(guān)，它可以特異性地識別啟始信號，并指導(dǎo)RNA聚合酶與之結(jié)合。-亞基是酶的催化作用核心，上面有抗生素利福平的結(jié)合位點。

′-亞基由許多堿性氨基酸構(gòu)成，在酶與模板DNA的結(jié)合中起重要作用。-亞基則與酶和啟始位點的結(jié)合有關(guān)。

真核生物體內(nèi)RNA聚合酶有三種，分別是RNA聚合酶I、II、III，其中，RNA聚合酶I與rRNA前體合成有關(guān)，RNA聚合酶II與mRNA前體合成有關(guān)，RNA聚合酶III則與tRNA前體合成有關(guān),結(jié)構(gòu)也有不同。RNA聚合酶催化的反應(yīng)ACGACGUU模板DNA5′3′5′3′新合成RNARNA合成過程起始雙鏈DNA局部解開磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區(qū)到達(dá)基因終點延長階段5

3

RNA

啟動子（promoter)

終止子(terminator)5

RNA聚合酶

5

3

5

3

5

5

3

離開RNA鏈的延伸圖解3′3′RNA-DNA雜交螺旋聚合酶的移動方向新生RNA復(fù)鏈解鏈有義鏈模板鏈（反義鏈）延長部位

(4)終止當(dāng)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行到終止位點時，RNA的延長作用停止。最簡單的終止信號是一段富含GC的回文區(qū)域及隨后的一段AT序列。對應(yīng)于此區(qū)段的RNA可以形成一個富含GC堿基對的發(fā)夾結(jié)構(gòu)及一段富含UA的區(qū)段，由于U-A堿基對間的作用力弱，有利于RNA鏈從模板上解離，終止其合成。對于沒有這種結(jié)構(gòu)的RNA合成的終止，需要借助于專門的終止因子的作用，因子可以與RNA聚合酶結(jié)合，使聚合酶活性轉(zhuǎn)變成水解酶活性，使RNA鏈從模板上釋放，終止合成。圖9-31RNA生物合成的終止3.真核生物的轉(zhuǎn)錄作用(1)轉(zhuǎn)錄酶類不同。(2)啟動子種類不同，RDDPⅠ在起始部位的5‘-端，RDDPⅡ是多啟動子，RDDPⅢ是內(nèi)部啟動子。(3)轉(zhuǎn)錄的過程雖然也可以分為三個或四個階段，但具體情況要比原核復(fù)雜得多。

4.RNA的轉(zhuǎn)錄后加工剛轉(zhuǎn)錄形成的RNA分子往往還需要經(jīng)過進(jìn)一步的加工修飾才能形成有活性的RNA。這個過程稱為轉(zhuǎn)錄后加工。RNA的轉(zhuǎn)錄后加工一般包括外顯子的剪接、核苷酸修飾、RNA編輯及必須基團(tuán)的添加四種方式。（1）mRNA合成后加工①5′-端合成帽子結(jié)構(gòu)真核生物成熟的mRNA其5′-端均有7-甲基三磷酸鳥苷(m7G5’ppp5’N…)結(jié)構(gòu)（帽子結(jié)構(gòu)）。②3′-OH端形成PolyA尾巴催化此反應(yīng)的酶是多聚腺苷酸聚合酶。③某些核苷酸的甲基化修飾。④內(nèi)含子的切除mRNA前體中的內(nèi)含子（不具編碼意義的核苷酸序列）被切除除去。圖9-31真核細(xì)胞mRNA的“帽子”結(jié)構(gòu)內(nèi)含子的準(zhǔn)確剪接與內(nèi)含子的典型結(jié)構(gòu)有關(guān)，內(nèi)含子總以GU開始，以AG結(jié)束，在內(nèi)含子3′-端附近有一段10個左右的嘧