啤酒廢棄酵母泥除雜脫苦工藝研究

啤酒廢棄酵母泥除雜脫苦工藝研究

近年來的一些研究表明，梨糖酸及其龐大的不完全脫水產(chǎn)物，如肌苷酸（imp）、鳥苷酸（mp）、細胞苷酸（cmp）和尿苷酸（ump），在醫(yī)藥、食品、保健品、農(nóng)業(yè)等行業(yè)發(fā)揮著重要作用。其中鳥苷酸(GMP)和肌苷酸(IMP)是強力助鮮劑,胞苷酸(CMP)和尿苷酸(UMP)可作為生產(chǎn)治療癌癥、肝炎及冠心病等藥物的原料。在化妝品中加入核酸或其水解物,可促進皮膚蛋白合成,達到養(yǎng)護皮膚的作用。在農(nóng)業(yè)上,RNA降解物具有促進作物生長增產(chǎn)的作用,已在水稻、小麥、柑橘及多種蔬菜生產(chǎn)中應(yīng)用,取得了明顯的增產(chǎn)效果。進一步研究表明核糖核酸具有維持機體免疫功能、抗氧化、提高機體蛋白質(zhì)和鐵的生物利用率、降低膽固醇和抗衰老等多種生理功能。因此,核糖核酸的開發(fā)研究越來越受到重視。啤酒廢酵母是啤酒生產(chǎn)的副產(chǎn)物,每生產(chǎn)100噸啤酒大約有1~1.5噸啤酒廢酵母產(chǎn)生。我國年產(chǎn)啤酒已超過2000萬噸,每年啤酒廢酵母的排放量達20~30萬噸。啤酒廢酵母營養(yǎng)價值相當(dāng)豐富,它由約40%~50%蛋白質(zhì)、6%~8%核酸、30%~50%碳水化合物、2.8%~3.0%脂質(zhì)、5%~7%水分和6%~7%灰分組成,且氨基酸組成合理,并同時含有豐富的維生素和礦物質(zhì)。因此,合理利用這一資源既減少環(huán)境污染,又可創(chuàng)造極其可觀的經(jīng)濟效益。目前,從啤酒廢酵母中提取核糖核酸的方法較多,包括鹽法、稀堿法、機械法、氨法、自溶法、酶法等,其各自優(yōu)缺點對比分析見表1。本實驗以啤酒廢棄酵母泥為研究對象,著重探討了啤酒廢棄酵母泥除雜、膠苦與其RNA提取技術(shù)參數(shù),以期為啤酒生產(chǎn)企業(yè)解決廢棄酵母泥污物提供一條切實可行的技術(shù)路線。1材料和方法1.1廢棄酵母泥的制備全麥啤酒、輔料啤酒、黑麥啤酒、小麥啤酒4種廢棄酵母泥均由金漢斯集團公司提供。DEPC試劑Sigma公司;碳酸氫鈉、酒石酸、氯化鈉、無水乙醇、鹽酸等分析純試劑北京化工廠。1.2日本hh-s試驗J-6型多頭磁力加熱攪拌器江蘇金壇榮華儀器制造有限公司;CR20B2型高速冷凍離心機日本日立公司;HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋常州市國立試驗設(shè)備研究所;ZD-2型自動電位滴定儀上海虹益儀器儀表有限公司;T6新悅-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。1.3啤酒廢酵母酵母細胞廢棄啤酒酵母泥的預(yù)處理與提取RNA的工藝流程如下:啤酒廢酵母→酵母懸液→除雜→脫苦→離心→棄上清液→干凈酵母細胞→配制酵母懸液→鹽析→冷卻→離心→乙醇沉淀并調(diào)pH值→過夜→離心→已醇洗滌→離心→RNA1.4rna純度測定采用紫外分光光度法測定核糖核酸產(chǎn)品純度,通過A260/A280的比值來檢測其純度。當(dāng)比值在1.7~1.9之間時,RNA的純度較好;若比值小于1.7,則表明蛋白雜質(zhì)較多;若大于1.9,則表明RNA已經(jīng)降解。1.5rna含量的測定采用紫外分光光度法測定核糖核酸含量。通過分光光度計測定RNA溶液在260nm處的吸收度并計算RNA的含量,要求分光光度計A260的讀數(shù)介于0.15~1.0之間為可靠值。按公式(1)計算總RNA濃度。1.6r1提取率的計算4種啤酒廢酵母中RNA提取率公式如下:1.7核酸rna高溫鹽析法提取核糖核酸是基于改變酵母細胞的滲透壓,加熱使細胞自身裂解而釋放出核糖核酸。利用核酸溶于水和在等電點溶解度最小的性質(zhì),調(diào)節(jié)pH值,使其從溶液中沉淀下來,洗滌離心,收集粗品RNA。采用L16(45)正交試驗設(shè)計考察酵母濃度A、NaCl濃度B、抽提溫度C、抽提時間D四個主要因素對A260/A280(Y1)、核酸含量(Y2)、提取率(Y3)三指標(biāo)的影響。2結(jié)果與分析2.1啤酒廢酵母泥的除雜效果回收酵母泥含有麥芽殼,酒花沉淀、析出蛋白質(zhì)沉淀等物質(zhì),提取RNA之前必須經(jīng)過洗滌、除雜等工藝處理。不同的酵母懸液濃度和不同大小的篩目對啤酒廢酵母泥的除雜有著不同的影響,尤其是酵母懸液濃度。當(dāng)濃度大時,易成糊狀,泡沫多,且難過篩,酵母損失大。經(jīng)大量預(yù)實驗,在過篩2次的前提下,以干凈酵母泥的得率為考察指標(biāo),其結(jié)果如圖1所示,80目除雜效果明顯高于100目。因此,確定最佳除雜工藝為:酵母懸液濃度8%,過80目篩兩次。2.2脫苦時間與脫苦劑的篩選啤酒釀制過程中,添加的啤酒酒花及其代謝產(chǎn)物吸附在酵母細胞表面使其呈現(xiàn)淡咖啡色,并帶有苦味與令人不愉快的酵母味。因此提取RNA前必須經(jīng)脫苦處理,使酵母顏色由深褐色變?yōu)榘咨?以保證對后續(xù)提取物質(zhì)不產(chǎn)生副作用。啤酒廢酵母泥的苦味是由酒花中的α-酸所導(dǎo)致,經(jīng)脫苦離心后,得到廢酵母泥沉淀,測上清液中的電導(dǎo)率。電導(dǎo)率越大,說明α-酸含量越多,即吸附在廢酵母泥表面的酒花及其代謝產(chǎn)物越少,脫苦效果越好。以經(jīng)脫苦后的電導(dǎo)率(ms/cm)和pH值為考察指標(biāo),擬篩選脫苦時間與脫苦劑的條件,結(jié)果如圖2所示。圖2可知,酒石酸的脫苦效果好于碳酸氫鈉。隨著脫苦時間的延長,酵母懸液的電導(dǎo)率加大,說明隨著時間的延長,脫苦效果越明顯。但是,當(dāng)脫苦時間達到30min后,脫苦時間對酵母懸液電導(dǎo)率的影響已經(jīng)不太顯著。因此,本著增加電導(dǎo)率并且節(jié)省時間兩方面考慮,選擇5%酒石酸脫苦30min。2.3不同原料的啤酒廢酵母脫苦效果利用2.1和2.2確定的最佳工藝分別對四種啤酒廢酵母進行了除雜、脫苦,其對比分析結(jié)果如圖3所示。圖3可知,四種來源啤酒廢酵母的脫苦程度順序依次為:輔料>黑麥>小麥>全麥。比較四種干凈啤酒廢酵母泥得率大小依次為:小麥>全麥>黑麥>輔料。2.4最佳提取工藝的確定采用L16(45)正交試驗設(shè)計,極差分析結(jié)果如表2所示。由表2中的A260/A280極差分析結(jié)果可知,考察因素的主次順序如下:D(抽提時間)>A×B>B(NaCl濃度)>C(抽提溫度)>A(酵母濃度)。由表3選擇A×B交互作用最優(yōu)組合為A2B1,故獲得高純度RNA的最佳提取工藝為:A2B1C3D4,即提取時間3h,提取溫度95℃,酵母濃度6%,NaCl濃度6%。由表2中的核酸含量極差分析結(jié)果可知,考察因素的主次順序如下:D(抽提時間)>A×B>C(抽提溫度)>A(酵母濃度)>B(NaCl濃度),由表3選擇A×B交互作用最優(yōu)組合為A4B3,故獲得高含量RNA的最佳提取工藝為:A4B3C4D4,即提取時間5h,提取溫度100℃,酵母濃度10%,NaCl濃度10%。由于實驗是期望優(yōu)化獲得核糖核酸提取率較高的工藝技術(shù)參數(shù),故由表2中的核酸提取率極差分析結(jié)果可知考察因素的主次順序如下:D(抽提時間)>C(抽提溫度)>A×B>A(酵母濃度)>B(NaCl濃度),并由表3選擇A×B交互作用最優(yōu)組合為A1B4,故獲得高RNA提取率的最佳提取工藝為:A1B4C4D4,即提取時間5h,提取溫度100℃,酵母濃度4%,NaCl濃度12%,為L16(45)正交試驗方案中的第四組實驗,A260/A280值為1.62,核酸含量為8.46mg/ml,核酸提取率為13.8%。3結(jié)論3.1啤酒酵母泥提取率當(dāng)采用8%的酵母懸液濃度,過80目篩兩次除雜,5%酒石酸脫苦30min時,可獲