柴胡皂甙d對人肝癌細(xì)胞sa3、cox-2表達(dá)的影響

柴胡皂甙d對人肝癌細(xì)胞sa3、cox-2表達(dá)的影響

核電站大道是惡性最嚴(yán)重的腫瘤之一。具體研究和發(fā)現(xiàn)的機(jī)制是當(dāng)前研究的焦點(diǎn)之一。環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是花生四烯酸代謝中的重要限速酶,它在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中高度表達(dá),被認(rèn)為是參與腫瘤發(fā)生的重要因素。柴胡皂甙d(saikosaponin-d,SSd)是從傳統(tǒng)中藥柴胡中分離、提取出來的藥理活性最強(qiáng)的成分之一,大量研究顯示它可以抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,但機(jī)制尚不明確。我們前期的研究顯示SSd可明顯下調(diào)肝癌細(xì)胞COX-2的表達(dá),抑制PGE2的生成,進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖,然而SSd抑制COX-2表達(dá)的具體分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。近來有研究提示信號傳導(dǎo)子與激活子3(STAT3)可能參與了COX-2蛋白的表達(dá)調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)擬通過研究STAT3在COX-2表達(dá)調(diào)節(jié)過程中的作用,探索SSd發(fā)揮抗癌作用的機(jī)制,為開發(fā)應(yīng)用SSd防治肝癌等消化系統(tǒng)腫瘤提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1細(xì)胞免疫試劑人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床分子生物中心陳葳主任惠贈。IL-6購自美國Peprotech公司;AG490及MTT均購自美國Sigma公司;SSd購自江西本草天工有限公司;免疫細(xì)胞化學(xué)使用的一抗兔抗人多克隆抗體STAT3、COX2及S-P免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒購自北京博奧森公司;DAB底物顯色試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液購自北京天根公司;蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑為Roche公司產(chǎn)品;免疫印跡使用的一抗兔抗人多克隆抗體STAT3、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購自SantaCruz公司;免疫印跡、免疫細(xì)胞化學(xué)使用的一抗兔抗人單克隆抗體Tyr705Phospho-Stat3及免疫印跡使用的兔抗人單克隆抗體COX-2均購自CellSignalingTechnology公司。1.2方法1.2.1細(xì)胞增殖檢測人肝癌SMMC-7721細(xì)胞接種于含10%(體積分?jǐn)?shù))新生牛血清(血清56℃,30min滅活),青霉素和鏈霉素各為100U/ml的RPMI1640培養(yǎng)液中,置37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),以本組報(bào)道過的常規(guī)MTT法檢測細(xì)胞增殖。1.2.2免疫細(xì)胞化學(xué)染色將對數(shù)生長期的細(xì)胞采用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組,每組均設(shè)6個復(fù)孔?？瞻讓φ战M、IL-6(25ng/ml)誘導(dǎo)組、AG490干預(yù)組(IL-625ng/ml+AG49050μmol/L)、SSd組(IL-625ng/ml+SSd5μg/ml)檢測p-STAT3、COX2蛋白的定位及表達(dá)?？瞻讓φ战M、SSd組檢測STAT3蛋白的定位及表達(dá)。24h后收集細(xì)胞爬片,4%多聚甲醛固定,-20℃保存。按照博奧森公司的染色試劑盒說明書進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色(S-P法)。一抗為STAT3(稀釋度為1∶600)、p-STAT3(稀釋度為1∶50),COX-2(稀釋度為1∶400)。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)。1.2.3重組蛋白的提取將對數(shù)生長期細(xì)胞采用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組:空白對照組、IL-6(25ng/ml)誘導(dǎo)組、IL-6(25ng/ml)+AG490(10、50、100μmol/L)組、IL-6(25ng/ml)組+SSd(2.5、5.0、10.0μg/ml)組。細(xì)胞蛋白的提取:將培養(yǎng)皿置冰上,4℃預(yù)冷PBS漂洗,刮下細(xì)胞吸入EP管中,離心,棄上清后添加RIPA裂解液,4℃冰上裂解1h,14000×g離心力4℃離心20min,取上清。Bradford法測定蛋白濃度。取50μg總蛋白上樣,經(jīng)5%濃縮膠,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,PVDF膜半干轉(zhuǎn)法15V轉(zhuǎn)印30min,5%脫脂奶粉封閉60min,5%BSA-TBST稀釋一抗STAT3(1∶200)、p-STAT3(1∶1000)、COX-2(1∶500),4℃孵育過夜,TBST洗膜后,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(工作濃度1∶20000)孵育60min。TBST洗膜后,ECL增強(qiáng)發(fā)光,感光膠片、顯影、定影。β-actin蛋白為內(nèi)參照,圖像掃描,分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法計(jì)量資料以xˉ±sxˉ±s表示,采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料應(yīng)用Fisher確切概率法分析。2結(jié)果2.1sd抑制劑的時間依賴SSd對肝癌細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用,且隨SSd作用終濃度和時間的變化而變化,在一定范圍內(nèi)呈明顯的劑量和時間依賴性,其中以10μg/mlSSd作用48h的抑制率最高,可達(dá)75%(圖1)。2.2ag490對il-6誘導(dǎo)p-stat3表達(dá)的影響p-STAT3僅在細(xì)胞核中表達(dá),COX-2定位于胞質(zhì)及核膜周圍,STAT3主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),陽性染色均呈棕黃色顆粒(圖2～4)。在空白對照組中有少量p-STAT3表達(dá)(圖2A),經(jīng)IL-6誘導(dǎo),p-STAT3表達(dá)增強(qiáng)后,COX-2蛋白的表達(dá)也呈現(xiàn)明顯的升高趨勢(圖2B、3B),且與空白對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表1)。當(dāng)AG490抑制p-STAT3表達(dá)后,COX-2的表達(dá)同樣出現(xiàn)下調(diào)(圖2C、3C),且同IL-6誘導(dǎo)組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表1)。SSd具有抑制p-STAT3和COX-2蛋白的表達(dá)的作用(圖2D、3D),同IL-6誘導(dǎo)組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表1),但SSd對STAT3蛋白表達(dá)的影響同空白對照組相比無明顯差異(P>0.05,圖4,表2)。2.3ag490和sd對小鼠stat3蛋白表達(dá)的影響p-STAT3與COX-2在空白對照組中就有表達(dá),經(jīng)IL-6作用后,p-STAT3和COX-2的表達(dá)較空白對照組相比明顯增強(qiáng),AG490和SSd均呈劑量依賴性抑制了p-STAT3和COX-2的表達(dá),而SSd不影響STAT3蛋白的表達(dá)(圖5、6,表3、4)。3sd與cox-2基因表達(dá)的關(guān)系COX-2在多種腫瘤組織中如肺腺癌、乳腺癌、食管癌等表達(dá)明顯高于正常組織,而流行病學(xué)提示長期服用NSAIDs的患者發(fā)生腫瘤的危險性大大降低,因此有人認(rèn)為COX-2是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素。近年研究報(bào)道,COX-2在絕大多數(shù)的肝細(xì)胞癌組織內(nèi)呈過表達(dá)。雖然COX-2過表達(dá)在腫瘤發(fā)生中的作用仍不明確,但可能與其導(dǎo)致PGs的合成增多誘導(dǎo)的bcl-2蛋白的表達(dá)增高以及下調(diào)p53的下游靶基因,使細(xì)胞增殖與凋亡失衡等有關(guān)。STAT3信號傳導(dǎo)通路與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡密切相關(guān),STAT3過度激活后可誘導(dǎo)多種基因如凋亡抑制基因、細(xì)胞周期調(diào)控基因及血管生成相關(guān)基因的高表達(dá),從而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化,目前被定義為癌基因。有研究顯示STAT3的活性形式(p-STAT3)不僅在肝癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織,而且與COX-2表達(dá)成正相關(guān)。近來發(fā)現(xiàn),COX-2基因的5′端存在一些潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列,如TATAbox、C/EBP序列、NF-IL6模序等,與此同時Yamaoka等證實(shí)在大鼠、小鼠以及人類的COX-2基因啟動子內(nèi)含有一種GAS序列,而該序列為Stats結(jié)合區(qū)域,提示STAT3可能參與COX-2的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,用JAK2抑制劑AG490阻斷JAK2介導(dǎo)的STAT3磷酸化后,肝癌細(xì)胞中COX-2蛋白表達(dá)含量明顯下調(diào),而加入IL-6誘導(dǎo)磷酸化STAT3生成增加后COX-2蛋白表達(dá)含量也相應(yīng)發(fā)生上調(diào),進(jìn)一步證實(shí)STAT3可能通過磷酸化和去磷酸化的形式參與了肝癌細(xì)胞COX-2表達(dá)的調(diào)節(jié)。SSd是從傳統(tǒng)中藥柴胡中分離、提取出來的藥理活性最強(qiáng)的成分之一,通常認(rèn)為具有解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎等藥理作用,近年研究表明:SSd可通過抑制肝腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡、抑制腫瘤血管的生成等幾個方面達(dá)到抗肝腫瘤的作用。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SSd可明顯降低二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)肝癌大鼠的死亡率以及肝癌結(jié)節(jié)的數(shù)量,同時應(yīng)用SSd對體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞研究顯示SSd可以抑制腫瘤細(xì)胞SMMC-7721增殖,同時COX-2蛋白表達(dá)發(fā)生明顯下調(diào),前列