flpfr位點特異性重組系統(tǒng)在植物轉基因中的應用

flpfr位點特異性重組系統(tǒng)在植物轉基因中的應用

以轉移技術為代表的植物互補技術為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了強有力的支持，但通過有效選擇轉移植物并選擇合適的基因（如抗生素基因、添加劑基因等）的使用，增加了植物轉世的安全性。因此,培育具有安全選擇標記基因或無選擇標記基因的轉基因植物成為提高轉基因植物安全性的有效手段。其策略之一是在轉化植株篩選完成后,采取一系列措施將選擇標記基因刪除。來自于啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)細胞核內2μm質粒的FLP/frt位點特異性重組系統(tǒng)中重組酶FLP可催化位于同一分子上兩個同向frt位點間DNA片段的切除,其重組功能已在煙草、擬南芥、和水稻細胞、玉米細胞中得到驗證,利用該系統(tǒng)可實現(xiàn)篩選完成后選擇標記基因的刪除。植物基因啟動子是重要的順式作用元件,處于基因轉錄調控的中心環(huán)節(jié)。多數(shù)生物對外界環(huán)境溫度升高最明顯的反應是熱激蛋白的表達,同時抑制體內原有的大部分mRNA和蛋白質的合成。由于熱激蛋白啟動子中熱誘導元件和熱激因子的保守性,熱誘導蛋白啟動子可被來自異源植物的熱激因子所識別并調控其啟動基因的表達。本工作構建出可有效去除轉基因植物中選擇標記基因的FLP/frt位點特異性重組系統(tǒng):含有frt位點的植物表達載體pCAMBIA1300_betA_frt_als_frt和含有由熱誘導啟動子hsp啟動的FLP重組酶基因的植物表達載體pCAMBIA1300_hsp_FLP_hpt。利用二次轉化的方式將二者先后轉入煙草植株,經(jīng)熱激處理后,重組酶FLP基因的表達可催化位于選擇標記基因als兩側同向frt位點間的重組反應,從而有效去除選擇標記基因als,產(chǎn)生無選擇標記的轉基因耐鹽耐旱煙草植株。1材料和方法1.1質粒、試劑與儀器煙草(Nicotianatabacum)品種Wisconsin38。質粒p35S_als、pCAMBIA1300_betA_hpt、pCAMBIA1300_hsp_GUS_hpt由本實驗室構建。質粒pROKⅡ、大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌LBA4404、啤酒酵母AS2399由本實驗室保存。質粒pCAMBIA1300購自澳大利亞。各種DNA限制酶和DNA修飾酶及其相應緩沖液購自TaKaRa公司。載體pGEM_T_EasyVector購自Promega公司。DIG標記試劑盒、DIG檢測試劑盒及尼龍膜購自Roche公司。DNA片段玻璃奶回收試劑盒購自博大泰克公司。除草劑綠黃隆購自沈陽農(nóng)藥廠(有效濃度25%)。質粒重組中用到的各種DNA序列及轉基因植株檢測中用到的各種引物序列(如表1所示)由上海博亞公司合成。1.2植物表達載體的組成1.2.1質粒pcambi1300flp的構建以啤酒酵母AS2399總DNA為模板,利用嵌套PCR方法克隆得到重組酶FLP基因編碼區(qū)并連入pT_easyvector進行測序。第一步PCR反應使用引物FLP1、FLP4,程序為:預變性95℃5min;變性95℃1min,退火56℃1min,延伸72℃3min,循環(huán)30次;過度延伸7min。嵌套PCR反應使用引物FLP2、FLP3,程序為:預變性95℃5min;變性95℃1min,退火56℃1min,延伸72℃1.5min,循環(huán)30次;過度延伸7min。用限制酶BamHⅠ和KpnⅠ從帶有FLP基因的pGEM_Teasy載體上切下測序正確的FLP基因全長編碼區(qū),同時質粒pROKⅡ也經(jīng)BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切,電泳分離后回收載體DNA,與FLP重組酶基因定向連接,重組得到含有FLP重組酶基因的植物表達載體pROKⅡ_FLP。然后用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切質粒pROKⅡ_FLP和pCAMBIA1300,分別回收帶有nos終止子的FLP基因全長編碼區(qū)和載體序列,將二者定向連接,重組得到質粒pCAMBIA1300_FLP_nos。最后,用BamHⅠ切質粒pCAMBIA1300_hsp_GUS_hpt和pCAMBIA1300_FLP_nos,分別回收hsp啟動子和載體序列,將二者連接后鑒定正反向,得到含有由熱誘導啟動子hsp啟動的重組酶FLP基因的植物表達載體pCAMBIA1300_hsp_FLP_hpt。1.2.2als基因片段的鑒定合成的寡核苷酸單鏈frt1與frt2、frt3與frt4按照圖1所示構建雙鏈frt位點,然后將它們作為接頭定向連接在用NcoⅠ和PstⅠ雙酶切質粒p35S_als產(chǎn)生的選擇標記基因als兩端。經(jīng)測序,als基因片段兩端帶有正確的frt位點序列。將帶有重組酶作用位點frt的als基因用XhoⅠ酶切后回收,同時質粒pCAMBIA1300_betA_hpt也用XhoⅠ酶切回收載體,將二者連接后鑒定正反向,構建得到選擇標記基因als兩側帶有同向frt位點的植物表達載體pCAMBIA1300_betA_frt_als_frt,并通過限制性內切酶酶切鑒定重組質粒。1.3煙草葉盤篩選用攜帶植物表達載體pCAMBIA1300_betA_frt_als_frt的農(nóng)桿菌LBA4404感染煙草葉盤,以除草劑綠黃隆為篩選劑篩選轉化植株。取轉入betA和als基因的煙草植株葉盤,用攜帶植物表達載體pCAMBIA1300_hsp_FLP_hpt的農(nóng)桿菌LBA4404進行再次轉化,以潮霉素和除草劑綠黃隆為篩選劑篩選轉化植株。1.4動子pcr擴增CTAB法提取煙草葉片DNA,對轉化植株進行PCR和Southern雜交檢測。檢測als、betA、FLP基因和hsp啟動子的PCR引物見表1,其反應程序為:預變性95℃5min;變性95℃1min,退火56℃1min,延伸72℃1.5min(檢測hsp啟動子時為30s),循環(huán)30次;過度延伸7min。限制酶KpnⅠ單酶切或限制酶BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切二次轉化植株基因組DNA,用探針FLP基因片段與之雜交。FLP基因片段的標記和雜交過程見DIG標記和檢測試劑盒說明書。1.5表面活性劑的選擇取呈betA、als、hsp和FLP陽性的二次轉化植株葉片進行熱激處理。將煙草葉片切成0.5cm2的葉盤,浸沒于1/2MS(MurashigeandSkoog)液體培養(yǎng)基中,置于42℃水浴振蕩熱激2h。取出葉盤置于1/2MS固體培養(yǎng)基上25℃恢復培養(yǎng)12h,再次置于42℃水浴振蕩熱激2h。然后取出葉盤置于加有6_BA(1mg/L)和IAA(0.1mg/L)的MS固體培養(yǎng)基上誘導不定芽發(fā)生。產(chǎn)生小苗后,對小苗進行選擇標記基因als是否切除的分子檢測。其引物分別為D1、D2、D3(見表1),結合位點如圖2所示。反應程序為:采用引物D1和D3時,預變性95℃5min;變性95℃1min,退火56℃1min,72℃延伸1.5min,循環(huán)30次;過度延伸7min。采用引物D2和D3時,預變性95℃5min;變性95℃1min,退火56℃1min,延伸72℃30s,循環(huán)30次;過度延伸7min?；厥找顳2、D3的PCR擴增產(chǎn)物,連入pT_easyvector進行測序。2結果和分析2.1同向frt的質粒結構以啤酒酵母AS2399總DNA為模板通過嵌套PCR擴增得到測序正確的FLP基因編碼區(qū),進一步重組得到含有FLP重組酶基因的植物表達載體pCAMBIA1300_hsp_FLP_hpt,其T_DNA區(qū)如圖3所示。利用分子重組技術成功的構建了含有同向frt位點的植物表達載體pCAMBIA1300_betA_frt_als_frt,其質粒結構圖如圖4所示。frt位點的測序結果為:frt12:GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTC(全長的重組酶識別位點48bp,包含由兩段13bp反向重復序列和一段8bp的不對稱序列組成的核心重組序列和與之相鄰的13bp序列及二者之間的堿基G)frt34:GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAAT(截短的重組酶識別位點39bp,包含由兩段13bp反向重復序列和一段8bp的不對稱序列組成的核心重組序列和與之相鄰的5bp序列GGAAT)。2.2eta、flp、hsp啟動子的擴增及分析用檢測betA和als基因的引物分別對一次轉化植株和對照植株(未轉化葉盤產(chǎn)生的植株)的基因組DNA進行PCR擴增。轉入外源als基因的植株擴增出1.7kb片段(圖5_A),轉入betA基因的植株擴增出0.9kb片段(圖5_B),而對照植株未擴增出目的條帶。用檢測betA、FLP基因及hsp啟動子的引物分別對二次轉化植株和對照植株的基因組DNA進行PCR擴增。轉入betA基因的植株擴增出0.9kb片段(圖6_A),轉入FLP基因的植株擴增出1.3kb片段(圖6_B),轉入hsp啟動子的植株擴增出0.3kb片段(圖6_C),未轉基因對照植株未擴增出目的條帶。以重組酶基因FLP片段為探針對二次轉化PCR檢測陽性的植株進行Southern雜交分析,轉基因植株顯示了預期雜交條帶,而非轉基因的對照植株沒有信號(圖7)。2.3flp重組酶基因als切除反應的鑒定及分析當二次轉化產(chǎn)生的同時含有目的基因betA和重組酶基因FLP的轉基因植株經(jīng)過熱激處理后,FLP重組酶基因的表達可切除位于兩個同向frt位點間的選擇標記基因als。選擇標記基因als未發(fā)生切除時,延伸時間有限的PCR反應無法高效擴增引物D1和D3之間、D2和D3之間的片段;選擇標記基因als精確切除后,可擴增得到D2和D3間的0.4kb的目的片段(圖8_A)、引物D1和D3間約1.7kb的目的片段(圖8_B)。在二次轉化的植株中,在用引物D2與D3進行PCR擴增時,還可擴增出pCAMBIA1300_hsp_FLP_hpt中hpt基因片段,該片段約1.4kb(圖8_A)。用引物D1、D3對經(jīng)熱激處理的127株二次轉化植株和對照植株的基因組DNA進行PCR擴增,41%(52/127)的植株擴增出1.7kb的條帶,表明在這些植株中發(fā)生了選擇標記基因als被切除的事件,而59%(75/127)的植株PCR擴增產(chǎn)物中不出現(xiàn)1.7kb的條帶,表明其選擇標記als基因未被切除。PCR擴增8株去選擇標記基因的植株的D2、D3間的DNA,產(chǎn)物回收后連入pT_easyvector進行測序,通過序列分析,確定FLP重組酶催化了兩個同向frt位點間選擇標記基因als的精確切除,在去選擇標記基因的植株中兩個特異性重組位點frt12,frt34已融合為一個frt34位點(圖9)。在少數(shù)用引物D1、D3擴增出現(xiàn)1.7kb條帶的植株中,當采用als特異性引物A1和A2進行PCR擴增時可產(chǎn)生1.7kb條帶,這表明在這些植株中只有部分細胞的選擇標記基因als被切除。分析其原因可能有:1.在本工作中,使用了熱誘導蛋白啟動子來啟動FLP重組酶基因的表達,由于是對二次轉化后陽性植株的葉盤進行熱激處理來誘導FLP基因表達,而來自葉盤邊緣的小苗可能起源于數(shù)個細胞,其中一些細胞在熱激處理后未去除選擇標記基因;2.選擇標記基因的多拷貝整合或切除后的重新整合導致切除反應未能達到預期效果;3.重組酶FLP的最適反應溫度是23～30℃,42℃的重復熱激可能對它的活性有一定的影響。3flp/frt位點特異性重組系統(tǒng)在植物中的重組效率和表達分析目前,選擇標記基因被廣泛應用于植物細胞的遺傳轉化,用以區(qū)分轉化和非轉化細胞,這對于轉化植株的高效獲得是至關重要的。但是當篩選完成后,選擇標記基因則不再有用,將之從轉基因植物中去除有著顯而易見的優(yōu)點:第一,大大提高了轉基因植物的生物安全性;第二,為多基因轉化使用同一選擇標記基因提供了可能性;第三,降低了對轉入的目的基因進行表達結果分析的復雜性;最后,減少了轉入的外源DNA的序列,提高了基因組的穩(wěn)定性。位點特異性重組系統(tǒng)為雙組分系統(tǒng),其中組分一編碼重組酶,催化組分二即兩個短的特異性的靶DNA序列之間的重組,利用該系統(tǒng)的特性,可以將靶序列之間的DNA序列刪除,達到去除選擇標記基因的目的。目前應用最為廣泛,方法上較為成熟的位點特異性重組系統(tǒng)為來自噬菌體P1的Cre/lox系統(tǒng)。Sauer等人首先在哺乳動物細胞中驗證了該系統(tǒng)可以介導位點特異性重組。Dale等人以煙草原生質體為材料用瞬時表達證明了Cre可以介導染色體外的DNA剪切、倒位和整合反應。2001年,Zuo等人構建了一種化學誘導自主切除系統(tǒng)CLX(Cre/loxDNAexcisionsystem),該系統(tǒng)轉化擬南芥結果表明經(jīng)β_雌二醇誘導后,CLX系統(tǒng)對受體植株標記基因區(qū)的切除效率高達100%。另外,我國林忠平等人也利用該系統(tǒng)獲得無標記基因的轉基因植物,證明了該系統(tǒng)的精確性及高效性。來自于啤酒酵母的FLP/frt位點特異性重組系統(tǒng)也有較多的報道。在已報道的工作中,采用報告基因GUS或抗生素抗性基因驗證了FLP重組酶基因的組成型表達可以實現(xiàn)位于兩同向frt位點間的基因刪除,在煙草中刪除效率為19%(23/121),在擬南芥中幾乎達到100%。但利用FLP/frt位點特異性重組系統(tǒng)刪除選擇標記基因的效率因FLP序列的差異和植物材料不同而出現(xiàn)明顯的差異,而且重組酶FLP在轉基因植物中的表達強度和frt位點序列長度的改變均會在一定程度上影響該系統(tǒng)在植物中的重組效率。在本實驗中,為有效提高FLP重組酶在轉基因植物中的表達強度,在FLP重組酶基因編碼區(qū)起始密碼子ATG前加入AACA使之含有植物核糖體易識別的起始翻譯序列。Lyznik等以玉米和水稻原生質體為受體的報告基因瞬時表達實驗發(fā)現(xiàn)frt位點序列長度的改變同樣會影響FLP/frt位點特異性重組系統(tǒng)在植物中的重組效率。1996年,Lyznik等在玉米的穩(wěn)定轉化細胞中使用全長的frt位點和由核心重組序列構成的截短的frt位點,DNA片段的切除效率較高。依據(jù)以上研究結果,為了提高FLP/frt位點特異性重組系統(tǒng)在轉基因植物中刪除選擇標記基因的效率,在構建含有frt位點的植物表達載體時,位于選擇標記基因兩側的frt位點一個是全長的frt位點,另一個為截短的frt位點。為了使