flpfr位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用

flpfr位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用

以轉(zhuǎn)移技術(shù)為代表的植物互補(bǔ)技術(shù)為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了強(qiáng)有力的支持，但通過有效選擇轉(zhuǎn)移植物并選擇合適的基因（如抗生素基因、添加劑基因等）的使用，增加了植物轉(zhuǎn)世的安全性。因此,培育具有安全選擇標(biāo)記基因或無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物成為提高轉(zhuǎn)基因植物安全性的有效手段。其策略之一是在轉(zhuǎn)化植株篩選完成后,采取一系列措施將選擇標(biāo)記基因刪除。來自于啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)細(xì)胞核內(nèi)2μm質(zhì)粒的FLP/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)中重組酶FLP可催化位于同一分子上兩個同向frt位點(diǎn)間DNA片段的切除,其重組功能已在煙草、擬南芥、和水稻細(xì)胞、玉米細(xì)胞中得到驗(yàn)證,利用該系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)篩選完成后選擇標(biāo)記基因的刪除。植物基因啟動子是重要的順式作用元件,處于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心環(huán)節(jié)。多數(shù)生物對外界環(huán)境溫度升高最明顯的反應(yīng)是熱激蛋白的表達(dá),同時抑制體內(nèi)原有的大部分mRNA和蛋白質(zhì)的合成。由于熱激蛋白啟動子中熱誘導(dǎo)元件和熱激因子的保守性,熱誘導(dǎo)蛋白啟動子可被來自異源植物的熱激因子所識別并調(diào)控其啟動基因的表達(dá)。本工作構(gòu)建出可有效去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標(biāo)記基因的FLP/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng):含有frt位點(diǎn)的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300_betA_frt_als_frt和含有由熱誘導(dǎo)啟動子hsp啟動的FLP重組酶基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300_hsp_FLP_hpt。利用二次轉(zhuǎn)化的方式將二者先后轉(zhuǎn)入煙草植株,經(jīng)熱激處理后,重組酶FLP基因的表達(dá)可催化位于選擇標(biāo)記基因als兩側(cè)同向frt位點(diǎn)間的重組反應(yīng),從而有效去除選擇標(biāo)記基因als,產(chǎn)生無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因耐鹽耐旱煙草植株。1材料和方法1.1質(zhì)粒、試劑與儀器煙草(Nicotianatabacum)品種Wisconsin38。質(zhì)粒p35S_als、pCAMBIA1300_betA_hpt、pCAMBIA1300_hsp_GUS_hpt由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。質(zhì)粒pROKⅡ、大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌LBA4404、啤酒酵母AS2399由本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pCAMBIA1300購自澳大利亞。各種DNA限制酶和DNA修飾酶及其相應(yīng)緩沖液購自TaKaRa公司。載體pGEM_T_EasyVector購自Promega公司。DIG標(biāo)記試劑盒、DIG檢測試劑盒及尼龍膜購自Roche公司。DNA片段玻璃奶回收試劑盒購自博大泰克公司。除草劑綠黃隆購自沈陽農(nóng)藥廠(有效濃度25%)。質(zhì)粒重組中用到的各種DNA序列及轉(zhuǎn)基因植株檢測中用到的各種引物序列(如表1所示)由上海博亞公司合成。1.2植物表達(dá)載體的組成1.2.1質(zhì)粒pcambi1300flp的構(gòu)建以啤酒酵母AS2399總DNA為模板,利用嵌套PCR方法克隆得到重組酶FLP基因編碼區(qū)并連入pT_easyvector進(jìn)行測序。第一步PCR反應(yīng)使用引物FLP1、FLP4,程序?yàn)?預(yù)變性95℃5min;變性95℃1min,退火56℃1min,延伸72℃3min,循環(huán)30次;過度延伸7min。嵌套PCR反應(yīng)使用引物FLP2、FLP3,程序?yàn)?預(yù)變性95℃5min;變性95℃1min,退火56℃1min,延伸72℃1.5min,循環(huán)30次;過度延伸7min。用限制酶BamHⅠ和KpnⅠ從帶有FLP基因的pGEM_Teasy載體上切下測序正確的FLP基因全長編碼區(qū),同時質(zhì)粒pROKⅡ也經(jīng)BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切,電泳分離后回收載體DNA,與FLP重組酶基因定向連接,重組得到含有FLP重組酶基因的植物表達(dá)載體pROKⅡ_FLP。然后用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切質(zhì)粒pROKⅡ_FLP和pCAMBIA1300,分別回收帶有nos終止子的FLP基因全長編碼區(qū)和載體序列,將二者定向連接,重組得到質(zhì)粒pCAMBIA1300_FLP_nos。最后,用BamHⅠ切質(zhì)粒pCAMBIA1300_hsp_GUS_hpt和pCAMBIA1300_FLP_nos,分別回收hsp啟動子和載體序列,將二者連接后鑒定正反向,得到含有由熱誘導(dǎo)啟動子hsp啟動的重組酶FLP基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300_hsp_FLP_hpt。1.2.2als基因片段的鑒定合成的寡核苷酸單鏈frt1與frt2、frt3與frt4按照圖1所示構(gòu)建雙鏈frt位點(diǎn),然后將它們作為接頭定向連接在用NcoⅠ和PstⅠ雙酶切質(zhì)粒p35S_als產(chǎn)生的選擇標(biāo)記基因als兩端。經(jīng)測序,als基因片段兩端帶有正確的frt位點(diǎn)序列。將帶有重組酶作用位點(diǎn)frt的als基因用XhoⅠ酶切后回收,同時質(zhì)粒pCAMBIA1300_betA_hpt也用XhoⅠ酶切回收載體,將二者連接后鑒定正反向,構(gòu)建得到選擇標(biāo)記基因als兩側(cè)帶有同向frt位點(diǎn)的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300_betA_frt_als_frt,并通過限制性內(nèi)切酶酶切鑒定重組質(zhì)粒。1.3煙草葉盤篩選用攜帶植物表達(dá)載體pCAMBIA1300_betA_frt_als_frt的農(nóng)桿菌LBA4404感染煙草葉盤,以除草劑綠黃隆為篩選劑篩選轉(zhuǎn)化植株。取轉(zhuǎn)入betA和als基因的煙草植株葉盤,用攜帶植物表達(dá)載體pCAMBIA1300_hsp_FLP_hpt的農(nóng)桿菌LBA4404進(jìn)行再次轉(zhuǎn)化,以潮霉素和除草劑綠黃隆為篩選劑篩選轉(zhuǎn)化植株。1.4動子pcr擴(kuò)增CTAB法提取煙草葉片DNA,對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR和Southern雜交檢測。檢測als、betA、FLP基因和hsp啟動子的PCR引物見表1,其反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性95℃5min;變性95℃1min,退火56℃1min,延伸72℃1.5min(檢測hsp啟動子時為30s),循環(huán)30次;過度延伸7min。限制酶KpnⅠ單酶切或限制酶BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切二次轉(zhuǎn)化植株基因組DNA,用探針FLP基因片段與之雜交。FLP基因片段的標(biāo)記和雜交過程見DIG標(biāo)記和檢測試劑盒說明書。1.5表面活性劑的選擇取呈betA、als、hsp和FLP陽性的二次轉(zhuǎn)化植株葉片進(jìn)行熱激處理。將煙草葉片切成0.5cm2的葉盤,浸沒于1/2MS(MurashigeandSkoog)液體培養(yǎng)基中,置于42℃水浴振蕩熱激2h。取出葉盤置于1/2MS固體培養(yǎng)基上25℃恢復(fù)培養(yǎng)12h,再次置于42℃水浴振蕩熱激2h。然后取出葉盤置于加有6_BA(1mg/L)和IAA(0.1mg/L)的MS固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽發(fā)生。產(chǎn)生小苗后,對小苗進(jìn)行選擇標(biāo)記基因als是否切除的分子檢測。其引物分別為D1、D2、D3(見表1),結(jié)合位點(diǎn)如圖2所示。反應(yīng)程序?yàn)?采用引物D1和D3時,預(yù)變性95℃5min;變性95℃1min,退火56℃1min,72℃延伸1.5min,循環(huán)30次;過度延伸7min。采用引物D2和D3時,預(yù)變性95℃5min;變性95℃1min,退火56℃1min,延伸72℃30s,循環(huán)30次;過度延伸7min?；厥找顳2、D3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,連入pT_easyvector進(jìn)行測序。2結(jié)果和分析2.1同向frt的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)以啤酒酵母AS2399總DNA為模板通過嵌套PCR擴(kuò)增得到測序正確的FLP基因編碼區(qū),進(jìn)一步重組得到含有FLP重組酶基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300_hsp_FLP_hpt,其T_DNA區(qū)如圖3所示。利用分子重組技術(shù)成功的構(gòu)建了含有同向frt位點(diǎn)的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300_betA_frt_als_frt,其質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖如圖4所示。frt位點(diǎn)的測序結(jié)果為:frt12:GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTC(全長的重組酶識別位點(diǎn)48bp,包含由兩段13bp反向重復(fù)序列和一段8bp的不對稱序列組成的核心重組序列和與之相鄰的13bp序列及二者之間的堿基G)frt34:GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAAT(截短的重組酶識別位點(diǎn)39bp,包含由兩段13bp反向重復(fù)序列和一段8bp的不對稱序列組成的核心重組序列和與之相鄰的5bp序列GGAAT)。2.2eta、flp、hsp啟動子的擴(kuò)增及分析用檢測betA和als基因的引物分別對一次轉(zhuǎn)化植株和對照植株(未轉(zhuǎn)化葉盤產(chǎn)生的植株)的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。轉(zhuǎn)入外源als基因的植株擴(kuò)增出1.7kb片段(圖5_A),轉(zhuǎn)入betA基因的植株擴(kuò)增出0.9kb片段(圖5_B),而對照植株未擴(kuò)增出目的條帶。用檢測betA、FLP基因及hsp啟動子的引物分別對二次轉(zhuǎn)化植株和對照植株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。轉(zhuǎn)入betA基因的植株擴(kuò)增出0.9kb片段(圖6_A),轉(zhuǎn)入FLP基因的植株擴(kuò)增出1.3kb片段(圖6_B),轉(zhuǎn)入hsp啟動子的植株擴(kuò)增出0.3kb片段(圖6_C),未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓晡磾U(kuò)增出目的條帶。以重組酶基因FLP片段為探針對二次轉(zhuǎn)化PCR檢測陽性的植株進(jìn)行Southern雜交分析,轉(zhuǎn)基因植株顯示了預(yù)期雜交條帶,而非轉(zhuǎn)基因的對照植株沒有信號(圖7)。2.3flp重組酶基因als切除反應(yīng)的鑒定及分析當(dāng)二次轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的同時含有目的基因betA和重組酶基因FLP的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過熱激處理后,FLP重組酶基因的表達(dá)可切除位于兩個同向frt位點(diǎn)間的選擇標(biāo)記基因als。選擇標(biāo)記基因als未發(fā)生切除時,延伸時間有限的PCR反應(yīng)無法高效擴(kuò)增引物D1和D3之間、D2和D3之間的片段;選擇標(biāo)記基因als精確切除后,可擴(kuò)增得到D2和D3間的0.4kb的目的片段(圖8_A)、引物D1和D3間約1.7kb的目的片段(圖8_B)。在二次轉(zhuǎn)化的植株中,在用引物D2與D3進(jìn)行PCR擴(kuò)增時,還可擴(kuò)增出pCAMBIA1300_hsp_FLP_hpt中hpt基因片段,該片段約1.4kb(圖8_A)。用引物D1、D3對經(jīng)熱激處理的127株二次轉(zhuǎn)化植株和對照植株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,41%(52/127)的植株擴(kuò)增出1.7kb的條帶,表明在這些植株中發(fā)生了選擇標(biāo)記基因als被切除的事件,而59%(75/127)的植株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物中不出現(xiàn)1.7kb的條帶,表明其選擇標(biāo)記als基因未被切除。PCR擴(kuò)增8株去選擇標(biāo)記基因的植株的D2、D3間的DNA,產(chǎn)物回收后連入pT_easyvector進(jìn)行測序,通過序列分析,確定FLP重組酶催化了兩個同向frt位點(diǎn)間選擇標(biāo)記基因als的精確切除,在去選擇標(biāo)記基因的植株中兩個特異性重組位點(diǎn)frt12,frt34已融合為一個frt34位點(diǎn)(圖9)。在少數(shù)用引物D1、D3擴(kuò)增出現(xiàn)1.7kb條帶的植株中,當(dāng)采用als特異性引物A1和A2進(jìn)行PCR擴(kuò)增時可產(chǎn)生1.7kb條帶,這表明在這些植株中只有部分細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因als被切除。分析其原因可能有:1.在本工作中,使用了熱誘導(dǎo)蛋白啟動子來啟動FLP重組酶基因的表達(dá),由于是對二次轉(zhuǎn)化后陽性植株的葉盤進(jìn)行熱激處理來誘導(dǎo)FLP基因表達(dá),而來自葉盤邊緣的小苗可能起源于數(shù)個細(xì)胞,其中一些細(xì)胞在熱激處理后未去除選擇標(biāo)記基因;2.選擇標(biāo)記基因的多拷貝整合或切除后的重新整合導(dǎo)致切除反應(yīng)未能達(dá)到預(yù)期效果;3.重組酶FLP的最適反應(yīng)溫度是23～30℃,42℃的重復(fù)熱激可能對它的活性有一定的影響。3flp/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在植物中的重組效率和表達(dá)分析目前,選擇標(biāo)記基因被廣泛應(yīng)用于植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化,用以區(qū)分轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞,這對于轉(zhuǎn)化植株的高效獲得是至關(guān)重要的。但是當(dāng)篩選完成后,選擇標(biāo)記基因則不再有用,將之從轉(zhuǎn)基因植物中去除有著顯而易見的優(yōu)點(diǎn):第一,大大提高了轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性;第二,為多基因轉(zhuǎn)化使用同一選擇標(biāo)記基因提供了可能性;第三,降低了對轉(zhuǎn)入的目的基因進(jìn)行表達(dá)結(jié)果分析的復(fù)雜性;最后,減少了轉(zhuǎn)入的外源DNA的序列,提高了基因組的穩(wěn)定性。位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)為雙組分系統(tǒng),其中組分一編碼重組酶,催化組分二即兩個短的特異性的靶DNA序列之間的重組,利用該系統(tǒng)的特性,可以將靶序列之間的DNA序列刪除,達(dá)到去除選擇標(biāo)記基因的目的。目前應(yīng)用最為廣泛,方法上較為成熟的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)為來自噬菌體P1的Cre/lox系統(tǒng)。Sauer等人首先在哺乳動物細(xì)胞中驗(yàn)證了該系統(tǒng)可以介導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組。Dale等人以煙草原生質(zhì)體為材料用瞬時表達(dá)證明了Cre可以介導(dǎo)染色體外的DNA剪切、倒位和整合反應(yīng)。2001年,Zuo等人構(gòu)建了一種化學(xué)誘導(dǎo)自主切除系統(tǒng)CLX(Cre/loxDNAexcisionsystem),該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化擬南芥結(jié)果表明經(jīng)β_雌二醇誘導(dǎo)后,CLX系統(tǒng)對受體植株標(biāo)記基因區(qū)的切除效率高達(dá)100%。另外,我國林忠平等人也利用該系統(tǒng)獲得無標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物,證明了該系統(tǒng)的精確性及高效性。來自于啤酒酵母的FLP/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)也有較多的報(bào)道。在已報(bào)道的工作中,采用報(bào)告基因GUS或抗生素抗性基因驗(yàn)證了FLP重組酶基因的組成型表達(dá)可以實(shí)現(xiàn)位于兩同向frt位點(diǎn)間的基因刪除,在煙草中刪除效率為19%(23/121),在擬南芥中幾乎達(dá)到100%。但利用FLP/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)刪除選擇標(biāo)記基因的效率因FLP序列的差異和植物材料不同而出現(xiàn)明顯的差異,而且重組酶FLP在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)強(qiáng)度和frt位點(diǎn)序列長度的改變均會在一定程度上影響該系統(tǒng)在植物中的重組效率。在本實(shí)驗(yàn)中,為有效提高FLP重組酶在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)強(qiáng)度,在FLP重組酶基因編碼區(qū)起始密碼子ATG前加入AACA使之含有植物核糖體易識別的起始翻譯序列。Lyznik等以玉米和水稻原生質(zhì)體為受體的報(bào)告基因瞬時表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)frt位點(diǎn)序列長度的改變同樣會影響FLP/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在植物中的重組效率。1996年,Lyznik等在玉米的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞中使用全長的frt位點(diǎn)和由核心重組序列構(gòu)成的截短的frt位點(diǎn),DNA片段的切除效率較高。依據(jù)以上研究結(jié)果,為了提高FLP/frt位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因植物中刪除選擇標(biāo)記基因的效率,在構(gòu)建含有frt位點(diǎn)的植物表達(dá)載體時,位于選擇標(biāo)記基因兩側(cè)的frt位點(diǎn)一個是全長的frt位點(diǎn),另一個為截短的frt位點(diǎn)。為了使