板栗殼提取物的抑菌活性研究

板栗殼提取物的抑菌活性研究

蘑菇屬于山毛櫸科植物。這是一種落葉樹，在中國廣泛種植，產(chǎn)量最高。板栗果肉的開發(fā)利用一直受到廣泛的關注,但隨之產(chǎn)生的板栗殼,則基本上未得到有效的開發(fā)就被丟棄浪費掉,所以挖掘板栗殼的實用價值很有意義。作者研究了板栗殼的乙醇水溶液提取物對細菌、酵母菌和霉菌的抑制作用,旨在開發(fā)出一種天然防腐劑,為板栗殼有效成分的提取及其在食品、制藥和日用化學等行業(yè)中的應用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1原材料板栗殼(某罐頭廠提供)。1.2酵母菌和霉菌細菌為大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis);酵母菌為啤酒酵母(Saccharomyescerevisiae)和赤酵母(Rhodotorulasp.);霉菌為黑曲霉(Aspergillusniger)和桔青霉(Penicilliumcitrinum)。以上菌種由武漢工業(yè)學院微生物實驗室提供。1.3培養(yǎng)基1.3.1ph值法樣品ph值取牛肉膏5.0g,蛋白胨10g,氯化鈉5.0g,瓊脂10g,水500mL,加熱溶化,調(diào)pH值7.4～7.6,分裝,高壓濕熱滅菌(121℃,20min),備用。1.3.2葡萄糖溶液制備將削皮后的馬鈴薯100g切成薄片,加200mL水煮沸20min,取汁加入10g葡萄糖,10g瓊脂,加熱溶化,定容至500mL,pH值自然,分裝,高壓濕熱滅菌(121℃,20min),備用。1.4有色固體提取物的制備板栗殼去雜、烘干、粉碎后置于燒杯中,加入30%的乙醇水溶液,固液質量比為1∶12,置于恒溫振蕩器上,在70℃下浸提4h、過濾,濾渣在同樣條件下再浸提4h、過濾,合并兩次濾液,真空蒸發(fā)濃縮,除雜,真空干燥得棕色固體提取物。1.5試驗菌液1.5.1菌種擴大培養(yǎng)細菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,酵母菌用馬鈴薯培養(yǎng)基。將供試菌種分別接種到裝有對應培養(yǎng)基的試管內(nèi),進行擴大培養(yǎng)。細菌在37℃培養(yǎng)24h,酵母菌在28℃培養(yǎng)24h。取活化好的菌種斜面,用無菌生理鹽水配制成(1～10)×106CFU/mL的菌懸液,備用。1.5.2霉菌芽孢菌懸液的制備將供試菌種分別斜面接種到馬鈴薯培養(yǎng)基中,在28℃培養(yǎng)72h,取活化好的菌種斜面,用無菌生理鹽水配制成(1～10)×106CFU/mL的霉菌孢子菌懸液,備用。1.6抗菌試驗1.6.1菌懸液的制備將吸水性強的濾紙(102型新華濾紙)用打孔器打成直徑為6mm的圓形小紙片,分裝于潔凈干燥的小培養(yǎng)皿中,干熱滅菌(160℃,2h)后,備用。將提取物溶于30%乙醇中,制備成質量分數(shù)為3%的溶液。用無菌鑷子將濾紙片放入以上溶液中,另取濾紙片放入30%乙醇和無菌水中作對比空白實驗,分別記作CK1和CK2,均浸泡24h。取制備好的菌懸液0.2mL,滴入已經(jīng)倒有相應固體培養(yǎng)基的平皿表面,用涂布器使其均勻分布在培養(yǎng)基的表面。用無菌鑷子夾取浸有上述3種液體的濾紙片,放入含菌平皿中,每皿3片。按上述相應條件培養(yǎng),每種菌作2個重復實驗,量取抑菌圈直徑,取平均值。1.6.2不同濃度苯甲酸鈉、山梨酸鉀提取物的生長情況測定在各平皿內(nèi),分別加入2mL質量分數(shù)為3%、2.5%、2%、1.5%、1.0%、0.5%和0.25%的板栗殼提取物溶液,然后每皿倒入10～15mL已溶化的固體培養(yǎng)基,混勻、冷卻、凝固后,每平皿加入0.2mL菌懸液,涂勻,在相應的溫度下培養(yǎng)一定時間(同上),觀察生長情況。每個濃度做2個重復實驗。防腐劑對照:按照上述方法,將提取物溶液換成不同濃度的苯甲酸鈉、山梨酸鉀水溶液作為對比,接種,培養(yǎng)。觀察結果是以不長菌的最低提取物溶液濃度為該提取物或防腐劑的最低抑菌濃度(MIC)。1.6.3熱處理對板栗殼提取物mic測定的影響用30%乙醇配成質量分數(shù)為3%、2.5%、2%、1.5%、1.0%、0.5%和0.25%的板栗殼提取物溶液,分別置于80、100℃水浴和121℃濕熱條件下,熱處理15min,然后測定MIC。1.7感官評價的測定將豬肉、茄子、豆腐切成小塊煮熟,分別用板栗殼提取物水溶液(質量分數(shù)為5%)處理10min后,分裝于經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)皿中,置于30℃下培養(yǎng)48h,肉眼觀察食品感官變化情況。用無菌水作空白對照實驗。1.8改性纖維素在樣品中的穩(wěn)定性有效成分定性鑒定有幾種方法:1)將提取物濃縮液滴于濾紙上風干,以氨熏濾紙,觀察顏色變化;2)向提取物的水溶液中滴加醋酸鉛和氯化鐵水溶液,觀察顏色變化;3)向提取物的水溶液中加入鋅粉,再滴加濃鹽酸,觀察顏色變化;4)明膠實驗:取pH值為4的提取物水溶液2～3mL,緩慢滴入少量新鮮的明膠試劑(含有1%明膠和10%食鹽),觀察有無渾濁或沉淀現(xiàn)象發(fā)生;5)鐵礬實驗:向中性的提取物溶液中滴加數(shù)滴鐵礬溶液[1%的Fe2(SO4)3K2SO4·24H2O水溶液],觀察顏色變化。2結果與討論2.1抑菌圈的直徑濾紙片法實驗結果:CK1和CK2都無抑菌圈,而提取物溶液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母、赤酵母、黑曲霉、桔青霉的抑菌圈直徑依次為7.5、8.1、13.7、14.1、12.5和12.2mm。這表明30%乙醇和無菌水無抑菌性,而一定濃度的板栗殼提取物對供試菌種都有抑制作用,其中對酵母菌的抑制作用最為顯著,其次是霉菌,對供試細菌的抑制作用相對較弱,抑菌次序為:赤酵母>啤酒酵母>黑曲霉>桔青霉>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌。2.2板栗殼提取物的抑菌作用從表1可以看出,隨著提取物溶液濃度的增加,其抑菌作用越明顯,板栗殼提取物對供試細菌、酵母菌、霉菌的MIC依次為3%、0.5%、2.0%,可見板栗殼提取物在較低濃度下就有較明顯的抑菌作用。由表2可知,與目前常用的食品防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀相比,該提取物對供試的細菌和霉菌的抑制能力較低,但對供試酵母菌的抑制作用較強。考慮到合成防腐劑的毒副作用,以及我國豐富的板栗資源,從板栗殼中提取抑菌成分,用來制作天然食品防腐劑,應具有較好的開發(fā)價值。2.3低抑菌濃度當溫度為80、100和121℃時,板栗殼提取物的最低抑菌濃度分別:大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均為3%,啤酒酵母和赤酵母均為0.5%,黑曲霉和桔青霉均為2%。實驗結果表明,高溫對板栗殼提取物的抑菌能力無明顯影響。2.4豬肉的風味試驗實驗結果表明,用板栗殼提取物溶液處理過的茄子、豆腐和豬肉,其質地、色澤和氣味基本無變化,表面長菌不明顯;但未經(jīng)提取物溶液處理過的茄子和豆腐則都腐爛變質,表面長有明顯的菌膜,有餿臭味;未經(jīng)處理的豬肉表面有一層粘性物質,色澤黃黑,有腐臭味,表面長有厚的菌膜。所以板栗殼提取物對食品防腐具有一定的效果。2.5有黃酮類物質將濃縮液滴于濾紙上風干,以氨熏濾紙,產(chǎn)生了深黃色的顏色,當濾紙放久后,因氨的揮發(fā)而褪色,這是黃酮類化合物的反應性質;向提取物水溶液中加入氯化鐵溶液后,生成了藍黑色的沉淀,放置一段時間之后溶液的棕色基本褪去;向提取物的水溶液中加入醋酸鉛溶液后,有黃棕色沉淀生成,溶液的顏色也逐漸褪去,這些也是黃酮類物質的典型反應;向提取物的水溶液中加入鋅粉,再滴加濃鹽酸,1～2min后溶液呈紫紅色,表明有黃酮類物質存在。在pH值為4的提取物溶液中加入明膠試劑后,有沉淀生成;向中性的提取物溶液中加入鐵礬試劑后呈藍黑色反應。上述兩個定性實驗可以初步證明提取物中也含有可水解單寧。由上述定性實驗可知,板栗殼提取物中含有黃酮類物質和可水解單寧,這些物質的分子中一般都含有鄰位酚羥基,具有與金屬離子絡合以及與蛋白質的強結合能力,都極大地影響到微生物對營養(yǎng)物質的吸收和細胞代謝活動的進行,所以上述物質的存在可能是板栗殼提取物具有抑菌性的原因。3板栗殼提取物的抑菌效果3.1板栗殼提取物對供試的菌種都有抑制作用,