板栗殼提取物的抑菌活性研究

板栗殼提取物的抑菌活性研究

蘑菇屬于山毛櫸科植物。這是一種落葉樹(shù)，在中國(guó)廣泛種植，產(chǎn)量最高。板栗果肉的開(kāi)發(fā)利用一直受到廣泛的關(guān)注,但隨之產(chǎn)生的板栗殼,則基本上未得到有效的開(kāi)發(fā)就被丟棄浪費(fèi)掉,所以挖掘板栗殼的實(shí)用價(jià)值很有意義。作者研究了板栗殼的乙醇水溶液提取物對(duì)細(xì)菌、酵母菌和霉菌的抑制作用,旨在開(kāi)發(fā)出一種天然防腐劑,為板栗殼有效成分的提取及其在食品、制藥和日用化學(xué)等行業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1原材料板栗殼(某罐頭廠提供)。1.2酵母菌和霉菌細(xì)菌為大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis);酵母菌為啤酒酵母(Saccharomyescerevisiae)和赤酵母(Rhodotorulasp.);霉菌為黑曲霉(Aspergillusniger)和桔青霉(Penicilliumcitrinum)。以上菌種由武漢工業(yè)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。1.3培養(yǎng)基1.3.1ph值法樣品ph值取牛肉膏5.0g,蛋白胨10g,氯化鈉5.0g,瓊脂10g,水500mL,加熱溶化,調(diào)pH值7.4～7.6,分裝,高壓濕熱滅菌(121℃,20min),備用。1.3.2葡萄糖溶液制備將削皮后的馬鈴薯100g切成薄片,加200mL水煮沸20min,取汁加入10g葡萄糖,10g瓊脂,加熱溶化,定容至500mL,pH值自然,分裝,高壓濕熱滅菌(121℃,20min),備用。1.4有色固體提取物的制備板栗殼去雜、烘干、粉碎后置于燒杯中,加入30%的乙醇水溶液,固液質(zhì)量比為1∶12,置于恒溫振蕩器上,在70℃下浸提4h、過(guò)濾,濾渣在同樣條件下再浸提4h、過(guò)濾,合并兩次濾液,真空蒸發(fā)濃縮,除雜,真空干燥得棕色固體提取物。1.5試驗(yàn)菌液1.5.1菌種擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,酵母菌用馬鈴薯培養(yǎng)基。將供試菌種分別接種到裝有對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基的試管內(nèi),進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。細(xì)菌在37℃培養(yǎng)24h,酵母菌在28℃培養(yǎng)24h。取活化好的菌種斜面,用無(wú)菌生理鹽水配制成(1～10)×106CFU/mL的菌懸液,備用。1.5.2霉菌芽孢菌懸液的制備將供試菌種分別斜面接種到馬鈴薯培養(yǎng)基中,在28℃培養(yǎng)72h,取活化好的菌種斜面,用無(wú)菌生理鹽水配制成(1～10)×106CFU/mL的霉菌孢子菌懸液,備用。1.6抗菌試驗(yàn)1.6.1菌懸液的制備將吸水性強(qiáng)的濾紙(102型新華濾紙)用打孔器打成直徑為6mm的圓形小紙片,分裝于潔凈干燥的小培養(yǎng)皿中,干熱滅菌(160℃,2h)后,備用。將提取物溶于30%乙醇中,制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的溶液。用無(wú)菌鑷子將濾紙片放入以上溶液中,另取濾紙片放入30%乙醇和無(wú)菌水中作對(duì)比空白實(shí)驗(yàn),分別記作CK1和CK2,均浸泡24h。取制備好的菌懸液0.2mL,滴入已經(jīng)倒有相應(yīng)固體培養(yǎng)基的平皿表面,用涂布器使其均勻分布在培養(yǎng)基的表面。用無(wú)菌鑷子夾取浸有上述3種液體的濾紙片,放入含菌平皿中,每皿3片。按上述相應(yīng)條件培養(yǎng),每種菌作2個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn),量取抑菌圈直徑,取平均值。1.6.2不同濃度苯甲酸鈉、山梨酸鉀提取物的生長(zhǎng)情況測(cè)定在各平皿內(nèi),分別加入2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、2.5%、2%、1.5%、1.0%、0.5%和0.25%的板栗殼提取物溶液,然后每皿倒入10～15mL已溶化的固體培養(yǎng)基,混勻、冷卻、凝固后,每平皿加入0.2mL菌懸液,涂勻,在相應(yīng)的溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間(同上),觀察生長(zhǎng)情況。每個(gè)濃度做2個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。防腐劑對(duì)照:按照上述方法,將提取物溶液換成不同濃度的苯甲酸鈉、山梨酸鉀水溶液作為對(duì)比,接種,培養(yǎng)。觀察結(jié)果是以不長(zhǎng)菌的最低提取物溶液濃度為該提取物或防腐劑的最低抑菌濃度(MIC)。1.6.3熱處理對(duì)板栗殼提取物mic測(cè)定的影響用30%乙醇配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、2.5%、2%、1.5%、1.0%、0.5%和0.25%的板栗殼提取物溶液,分別置于80、100℃水浴和121℃濕熱條件下,熱處理15min,然后測(cè)定MIC。1.7感官評(píng)價(jià)的測(cè)定將豬肉、茄子、豆腐切成小塊煮熟,分別用板栗殼提取物水溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%)處理10min后,分裝于經(jīng)過(guò)滅菌的培養(yǎng)皿中,置于30℃下培養(yǎng)48h,肉眼觀察食品感官變化情況。用無(wú)菌水作空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。1.8改性纖維素在樣品中的穩(wěn)定性有效成分定性鑒定有幾種方法:1)將提取物濃縮液滴于濾紙上風(fēng)干,以氨熏濾紙,觀察顏色變化;2)向提取物的水溶液中滴加醋酸鉛和氯化鐵水溶液,觀察顏色變化;3)向提取物的水溶液中加入鋅粉,再滴加濃鹽酸,觀察顏色變化;4)明膠實(shí)驗(yàn):取pH值為4的提取物水溶液2～3mL,緩慢滴入少量新鮮的明膠試劑(含有1%明膠和10%食鹽),觀察有無(wú)渾濁或沉淀現(xiàn)象發(fā)生;5)鐵礬實(shí)驗(yàn):向中性的提取物溶液中滴加數(shù)滴鐵礬溶液[1%的Fe2(SO4)3K2SO4·24H2O水溶液],觀察顏色變化。2結(jié)果與討論2.1抑菌圈的直徑濾紙片法實(shí)驗(yàn)結(jié)果:CK1和CK2都無(wú)抑菌圈,而提取物溶液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母、赤酵母、黑曲霉、桔青霉的抑菌圈直徑依次為7.5、8.1、13.7、14.1、12.5和12.2mm。這表明30%乙醇和無(wú)菌水無(wú)抑菌性,而一定濃度的板栗殼提取物對(duì)供試菌種都有抑制作用,其中對(duì)酵母菌的抑制作用最為顯著,其次是霉菌,對(duì)供試細(xì)菌的抑制作用相對(duì)較弱,抑菌次序?yàn)?赤酵母>啤酒酵母>黑曲霉>桔青霉>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌。2.2板栗殼提取物的抑菌作用從表1可以看出,隨著提取物溶液濃度的增加,其抑菌作用越明顯,板栗殼提取物對(duì)供試細(xì)菌、酵母菌、霉菌的MIC依次為3%、0.5%、2.0%,可見(jiàn)板栗殼提取物在較低濃度下就有較明顯的抑菌作用。由表2可知,與目前常用的食品防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀相比,該提取物對(duì)供試的細(xì)菌和霉菌的抑制能力較低,但對(duì)供試酵母菌的抑制作用較強(qiáng)?？紤]到合成防腐劑的毒副作用,以及我國(guó)豐富的板栗資源,從板栗殼中提取抑菌成分,用來(lái)制作天然食品防腐劑,應(yīng)具有較好的開(kāi)發(fā)價(jià)值。2.3低抑菌濃度當(dāng)溫度為80、100和121℃時(shí),板栗殼提取物的最低抑菌濃度分別:大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均為3%,啤酒酵母和赤酵母均為0.5%,黑曲霉和桔青霉均為2%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高溫對(duì)板栗殼提取物的抑菌能力無(wú)明顯影響。2.4豬肉的風(fēng)味試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用板栗殼提取物溶液處理過(guò)的茄子、豆腐和豬肉,其質(zhì)地、色澤和氣味基本無(wú)變化,表面長(zhǎng)菌不明顯;但未經(jīng)提取物溶液處理過(guò)的茄子和豆腐則都腐爛變質(zhì),表面長(zhǎng)有明顯的菌膜,有餿臭味;未經(jīng)處理的豬肉表面有一層粘性物質(zhì),色澤黃黑,有腐臭味,表面長(zhǎng)有厚的菌膜。所以板栗殼提取物對(duì)食品防腐具有一定的效果。2.5有黃酮類物質(zhì)將濃縮液滴于濾紙上風(fēng)干,以氨熏濾紙,產(chǎn)生了深黃色的顏色,當(dāng)濾紙放久后,因氨的揮發(fā)而褪色,這是黃酮類化合物的反應(yīng)性質(zhì);向提取物水溶液中加入氯化鐵溶液后,生成了藍(lán)黑色的沉淀,放置一段時(shí)間之后溶液的棕色基本褪去;向提取物的水溶液中加入醋酸鉛溶液后,有黃棕色沉淀生成,溶液的顏色也逐漸褪去,這些也是黃酮類物質(zhì)的典型反應(yīng);向提取物的水溶液中加入鋅粉,再滴加濃鹽酸,1～2min后溶液呈紫紅色,表明有黃酮類物質(zhì)存在。在pH值為4的提取物溶液中加入明膠試劑后,有沉淀生成;向中性的提取物溶液中加入鐵礬試劑后呈藍(lán)黑色反應(yīng)。上述兩個(gè)定性實(shí)驗(yàn)可以初步證明提取物中也含有可水解單寧。由上述定性實(shí)驗(yàn)可知,板栗殼提取物中含有黃酮類物質(zhì)和可水解單寧,這些物質(zhì)的分子中一般都含有鄰位酚羥基,具有與金屬離子絡(luò)合以及與蛋白質(zhì)的強(qiáng)結(jié)合能力,都極大地影響到微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和細(xì)胞代謝活動(dòng)的進(jìn)行,所以上述物質(zhì)的存在可能是板栗殼提取物具有抑菌性的原因。3板栗殼提取物的抑菌效果3.1板栗殼提取物對(duì)供試的菌種都有抑制作用,