發(fā)表：化學(xué)發(fā)光免疫法檢測BNP的分析靈敏度和檢測限值研究

PAGEPAGE1化學(xué)發(fā)光免疫法檢測B型利鈉肽的檢測限值和功能靈敏度研究李飛1，王偉佳2，溫冬梅2，索明環(huán)2，歐陽能良2，嚴(yán)海忠2，闞麗娟2，張秀明2（1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東廣州510080；2.中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，廣東中山528403）摘要：目的探討西門子ADVIACentaur240化學(xué)發(fā)光免疫系統(tǒng)檢測B型利鈉肽（BNP）的檢測限值和功能靈敏度。方法參照美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）EP-17A文件和有關(guān)文獻(xiàn)，選擇BNP通用稀釋液做空白樣品，批內(nèi)重復(fù)測定10次，計(jì)算光量子值的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，用以確定檢測低限（LLD）；同時(shí)，空白樣品每天上下午各檢測1批，每批重復(fù)檢測3次，連續(xù)檢測5天，共獲得30個(gè)空白結(jié)果，用非參數(shù)方法確定空白限(LoB)。制備接近1-4倍LoB濃度的系列實(shí)驗(yàn)樣品，各濃度每天上下午各檢測1次，連續(xù)檢測5天，計(jì)算每個(gè)濃度水平光量子值的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，用以確定生物檢測限（BLD）和CV值為10%條件下的功能靈敏度(FS)；同時(shí)，對所有80個(gè)測定結(jié)果，按EP-17A文件采用非參數(shù)方法確定檢出限(LoD)。結(jié)果ADVIACentaur240檢測系統(tǒng)BNP的LLD為1.47pg/ml,LoB為0.86pg/ml，均低于廠家聲明的靈敏度；BLD為3.27pg/ml-3.71pg/ml之間,LoD為3.54pg/ml,10%CV條件下的FS為4.64pg/ml。結(jié)論廠商聲明的LLD和BLD得到驗(yàn)證，同時(shí)建立本實(shí)驗(yàn)室BNP檢測的LoB，LoD和FS，可為臨床提供準(zhǔn)確可靠的檢驗(yàn)結(jié)果。建議臨床實(shí)驗(yàn)室使用EP-17A文件確定LoB和LoD，并確定在一定精密度條件下的功能靈敏度。關(guān)鍵詞：B型利鈉肽；空白限；檢出限；功能靈敏度；標(biāo)本類型ResearchontheDetectionLimitsandFunctionalSensitivityofChemiluminescenceImmunoassayintheDetectionofBNP.LIFei1,WANGWei-jia2,WENGDong-mei2，OUYANGNeng-liang2,KANLi-juan2,SUOMing-huan2,YANHai-zhong2,ZHANGXiu-ming2.(1.ThefirstaffiliatedhospitalofSunYat-senUniversity,GuangdongGuangzhou,510080,China;2.ZhongshanHospitalofSunYat-senUniversity,GuangdongZhongshan,528403,China)Abstract：ObjectiveToevaluatetheDetectionLimitsandFunctionalSensitivityperformance基金資助：廣東省醫(yī)學(xué)科研基金課題（A2009763），中山市科技局資助課題（20091A038）。作者簡介：李飛（1986-），女，中山大學(xué)在讀碩士，主要從事臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)，Email：l304781760@126.。ofSiemensADVIACentaur240AutomatedB-TypeNatriureticPeptide(BNP)Assay.MethodsUsingdocumentEP-17Apublishedin2004byAmericanClinicalandLaboratoryStandardsInstitution(CLSI).Eachblanksampleswaswith-intested10times,calculatetheLLD.ForthedeterminationofLoB,6replicatesofmanufacturer'sdilution（0pg/ml）on5separateruns（n=30）wereassayed.TheRLUsofblankandaserialdilutedsamplesdetectedbyBayerCentaur240chemiluminescenseimmunoassaysystemwouldbecalculatedtoaveragevalue,standarddeviationsandcoefficientofvariance,whichtoestablishtheBLDandfunctionalsensitivityofBNP.TheLoDwasdeterminedbyassaying2replicatesof8plasmapools(lowlevelsofBNP)on5separateruns(n=80).ResultsTheLLDwas1.47pg/mlandLoBwas0.86pg/ml.Theyarebothlowerthanthedeclarationofthemanufacturer.TheBLDwasbetween3.27pg/mland3.71pg/mlandtheLoDwas3.54pg/ml.Thefunctionalsensitivityofthecardiacbiochemicalmarkersthatcanreflectsomepathologicalchangesofthefunctionalsensitivitywas4.64pg/ml(thevalueof10%CV).ConclusionsTheLLD,BLD,LoBandLoDofBNPcouldmeetclinicalrequirements,whichalsovalidatethemanufacture’sdeclare.Atthesametime,wesetuptheLoBandLoDofBNPinourlaboratory,whichcanprovidemoreaccurateandtrustyresultsforourhospital.Theevaluatedocumentsaresimpleanduseful,sowesuggesttheclinicallaboratoryusedocumentEP17-AtosetupLoB,LoDandFSwhichmustaccordwiththeprecision.Keywords：B-typenatriureticpeptide;chemiluminescenceimmunoassay;LoB;LoD;FunctionalsensitivityB型利鈉肽（BrainNatriureticPeptide,BNP）是利鈉鈦家族中主要由心室分泌的一種神經(jīng)激素，自1988年發(fā)現(xiàn)至今，在心血管病診治方面的應(yīng)用越來越廣泛，多項(xiàng)臨床應(yīng)用準(zhǔn)則及指南均將其作為心衰疾病診斷和分級的重要指標(biāo)[1-4]。目前，BNP的定量檢測普遍采用西門子ADVIACentaur240、貝克曼、雅培等多個(gè)化學(xué)發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)，但國內(nèi)外均未見對其檢測限值和功能靈敏度等主要分析性能進(jìn)行驗(yàn)證或評價(jià)。作為檢驗(yàn)儀器的分析對象，其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性直接影響到了臨床醫(yī)生對疾病的診斷與治療。本研究主要參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）發(fā)布的EP17-A文件《檢出限和定量檢出限確定方案-批準(zhǔn)指南》[5]及有關(guān)文獻(xiàn)[6-7]對西門子ADVIACentuar化學(xué)發(fā)光免疫系統(tǒng)檢測BNP的檢測低限（Lowlimitofdetection，LLD）、空白限（Limitofblank，LoB）、生物檢測限（Biologiclimitofdetection，BLD）、檢出限（Limitofdetection，LoD）和10%CV時(shí)的功能靈敏度（Functionalsensitivity，F(xiàn)S）進(jìn)行驗(yàn)證和評價(jià)，旨在為臨床提供更可靠的診斷信息。對廠家聲明的檢測低限進(jìn)行驗(yàn)證并建立對定量報(bào)告具有重要意義的生物檢測限及功能靈敏度，也確定和建立了本實(shí)驗(yàn)室LoB及LoD的程序。對國內(nèi)外研究BNP在心血管病診治方面的應(yīng)用，是一個(gè)很好的補(bǔ)充。材料和方法一．試劑和儀器BNP采用西門子ADVIACentaur240化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定，專用稀釋液、校準(zhǔn)液（批號038148）、試劑（批號038153）和耗材由西門子公司原裝配套提供，質(zhì)控物（批號29742）由伯樂公司提供。二．實(shí)驗(yàn)方法1.標(biāo)本制備中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院2010年招募的健康志愿者新鮮EDTA抗凝血清15ml，1個(gè)小時(shí)分離血漿，所有樣本均無溶血、無黃疸、無脂濁。采用西門子ADVIACentaur240BNP測定專用稀釋液做系列稀釋，制備濃度為1.72pg/ml、2.58pg/ml、3.44pg/ml、4.30pg/ml、5.16pg/ml、6.02pg/ml、6.88pg/ml、7.74pg/ml系列低濃度樣本，共獲得8個(gè)不同濃度的系列實(shí)驗(yàn)樣品，低濃度樣本置于-70℃冰箱保存；稀釋液做空白樣品。2.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備按操作說明書對儀器進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)、校準(zhǔn)和質(zhì)量控制，在控后進(jìn)行樣品檢測。所有樣品分析前復(fù)溶，平衡至室溫后上機(jī)檢測。3.LLD的確定LLD為樣品單次檢測可以達(dá)到的檢測響應(yīng)量對應(yīng)的分析物量。按照國際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會的規(guī)定,測量置信水平為99.7%時(shí),方法的檢測低限由下式算出:檢測低限=3s空白/標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率,式中為s空白為10次空白測定的標(biāo)準(zhǔn)差。4.BLD實(shí)驗(yàn)在測量置信水平為99.7%時(shí)，低濃度樣品的檢測相應(yīng)量都比空白檢測相應(yīng)量大時(shí)樣品中所具有的分析物含量即為生物檢測限。在系列低濃度實(shí)驗(yàn)樣品中，某濃度下的光強(qiáng)度值均值減去3倍該樣品光強(qiáng)度值的標(biāo)準(zhǔn)差，剛大于LLD光強(qiáng)度值時(shí)對應(yīng)的分析物濃度即為BLD。5.LoB實(shí)驗(yàn)LoB是指空白樣本可能觀察到的最高測量結(jié)果。按國際標(biāo)準(zhǔn)化組織的要求，在規(guī)定Ⅰ類錯誤水平的條件下，空白分布尾部去掉百分后的臨界值即為LoB，即?？瞻讟悠访刻焐舷挛绺鳒y定一批，每批重復(fù)測定3次，連續(xù)5天，共獲得30個(gè)測量結(jié)果。因儀器直接報(bào)告的是濃度值,在低濃度時(shí)往往不呈正態(tài)分布,故采用非參數(shù)方法估計(jì)第95百分位數(shù)，即將數(shù)據(jù)由小到大排列，第95百分位數(shù)所在位置為[空白樣品總數(shù)×（95/100）+0.5]。6.LoD實(shí)驗(yàn)LoD是指樣本中可能檢測到的分析物最低量。按國際標(biāo)準(zhǔn)化組織的要求，在規(guī)定Ⅱ類錯誤水平=5%的條件下，確定LoD。系列低濃度實(shí)驗(yàn)樣品每天上下午各檢測1次，連續(xù)檢測5天，共獲得80個(gè)測量結(jié)果。因低濃度檢測數(shù)值常成非正態(tài)分布，故采用非參數(shù)方法確定LoD。，是低濃度樣品測定中位數(shù)和第5個(gè)百分位數(shù)的間距，中位數(shù)=檢測樣本總數(shù)×0.5+0.5，第5百分位數(shù)的值=檢測樣本總數(shù)×0.05+0.5。7.FS實(shí)驗(yàn)樣本制備和實(shí)驗(yàn)方法同LoD。根據(jù)《臨床生化科學(xué)院心臟標(biāo)志物應(yīng)用指南》[1-2]對BNP測定不精密度CV≤10%的要求，計(jì)算系列低濃度樣品測量結(jié)果的均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)（CV），CV最接近10%的實(shí)驗(yàn)樣品所具有的分析物含量即為功能靈敏度。三．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，LLD及BLD分析采用，s和CV表示LoB和LoD分析采用非參數(shù)方法；發(fā)光強(qiáng)度和濃度的關(guān)系曲線采用線性回歸方法完成。結(jié)果一．檢測低限和生物檢測限空白樣品和系列低濃度樣品的發(fā)光強(qiáng)度測定結(jié)果見表1、2。以系列低濃度樣品重復(fù)測定10次的平均濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，得出發(fā)光強(qiáng)度和濃度的關(guān)系曲線見圖1，回歸方程y=148.41x+18.409，求得發(fā)光強(qiáng)度為237時(shí)其相應(yīng)濃度為1.47pg/ml，即LLD=1.47pg/ml。由此可知，濃度為3.27pg/ml的樣品，其發(fā)光強(qiáng)度減3s后發(fā)光強(qiáng)度為169.8，小于237；濃度為3.71pg/ml的樣品，其發(fā)光強(qiáng)度減3s后發(fā)光強(qiáng)度為346.5，大于237，故BLD在3.27pg/ml~3.71pg/ml之間。表1空白樣品和系列低濃度樣品發(fā)光強(qiáng)度測定結(jié)果BNP(pg/ml）*發(fā)光強(qiáng)度0.00978926936106810531046942102991511591.7512091446126512301365128413011209130214402.8312961343137815611433156814501381135916533.2713711380158315611637148315721480152317503.7115761704160416391573166215401487147516264.6417941785176616351745168816041711171517945.7418621953191319791857198017661805191119886.4819961924201319712042199121351863198020367.782259218721782097223523012156207821532303注：*系列低濃度樣品10次重復(fù)測定值的均值表2系列低濃度樣重復(fù)測定10次扣除空白后的發(fā)光強(qiáng)度計(jì)算結(jié)果BNP(pg/ml）*x±s（發(fā)光強(qiáng)度）x-3s（發(fā)光強(qiáng)度）CV（%）**1.75284.1±86.823.730.62.85437.4±112.17502.9±112.6165.022.43.71567.6±73.7346.513.04.64702.7±66.3504880.4±77.368974.1±72.3781173.7±78.5938.16.7注：*系列低濃度樣品10次重復(fù)測定值的均值；**發(fā)光強(qiáng)度變化的日間不精密度圖1發(fā)光強(qiáng)度和濃度的關(guān)系曲線圖1發(fā)光強(qiáng)度和濃度的關(guān)系曲線二．空白限和檢出限采用非參數(shù)方法估計(jì)空白樣品測量結(jié)果第95百分位數(shù)，即第95百分位數(shù)=NB（95/100）+0.5，將所有30個(gè)空白結(jié)果由小到大排序，第1~21號均為0，第22~30號分別為0.05、0.07、0.31、0.46、0.47、0.51、0.67、0.86、1.51pg/ml，第29位數(shù)的結(jié)果為0.86pg/ml，，即pg/ml。系列低濃度樣品測定結(jié)果見表3。低濃度檢測結(jié)果成非正態(tài)分布，采用非參數(shù)方法估計(jì)LoD。將所有80個(gè)結(jié)果由小到大排序，第5百分?jǐn)?shù)=檢測樣本總數(shù)×0.05+0.5=4.5，經(jīng)計(jì)算得出第5百分位數(shù)的值為1.54pg/ml。低濃度樣本檢測值的中位數(shù)為:(第40秩號值+第41秩值）/2=（4.20+4.37）/2=4.28pg/ml;=中位數(shù)-第5百分位數(shù)=4.28-1.56=2.68pg/ml；LoD=LoB+Ds,β=0.86+2.68=3.54pg/ml。表3系列低濃度樣品測定結(jié)果樣品號重復(fù)測定結(jié)果（pg/ml）(%)11.052.751.411.731.051.742.721.750.6235.621.702.032.273.532.663.582.782.333.384.022.830.7793.183.344.033.003.602.983.274.773.270.7623.143.634.473.814.053.614.203.393.032.953.963.710.4913.255.425.024.884.024.744.373.814.524.545.064.640.4910.665.496.075.826.245.466.244.885.135.806.295.740.498.676.465.976.606.296.776.427.395.556.356.736.450.497.688.217.737.687.537.017.518.507.790.526.7三．功能靈敏度分別計(jì)算8個(gè)低濃度實(shí)驗(yàn)樣品測定結(jié)果的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)（CV），結(jié)果見表3。低濃度樣品測量結(jié)果與CV的關(guān)系見圖2。按照BNP檢測不精密度CV≤10%的質(zhì)量要求，由表3和圖2可以看出，在濃度為4.64pg/ml下，日間CV為10.6%，最接近10%，故在CV=10%時(shí)FS為4.64pg/ml。圖2低濃度樣品測量結(jié)果與CV的關(guān)系圖2低濃度樣品測量結(jié)果與CV的關(guān)系討論心血管疾病嚴(yán)重威脅著人類的健康，它是造成人類死亡的主要原因之一。特別心力衰竭患者的血漿BNP濃度檢查結(jié)果在診斷心力衰竭、估計(jì)預(yù)后、篩檢無癥狀左室功能異常和指導(dǎo)臨床治療四大方面都作了許多探討[8-10]。2008年ESC心衰診斷治療指南[11]明確指出：血漿BNP<100pg/ml，可排除心力衰竭；血漿BNP為100pg/ml-400pg/ml，其診斷不明確；血漿BNP>400pg/ml，血漿可診斷為心力衰竭。因此，BNP濃度變化對心力衰竭等疾病的診斷和治療監(jiān)測具有有重要的臨床價(jià)值。EP17-A文件是2004年美國CLSI頒布的《確定檢測低限和定量檢測限的方案》，該方案就如何確定臨床檢驗(yàn)方法的檢測低限，如何驗(yàn)證廠商聲明的檢測限值，如何正確使用和解釋各種限制，以及如何基于實(shí)驗(yàn)室在低水平濃度處的性能目標(biāo)確定定量檢測限提出了建議，且適用于所有的定量檢驗(yàn)項(xiàng)目。BNP作為定量檢測心衰的標(biāo)志物，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室必須就自身檢測儀器對之進(jìn)行檢測限值和功能靈敏度的比較和驗(yàn)證。Mueller等人[12]對AxSYM免疫發(fā)光分析儀進(jìn)行了評價(jià)，在未對檢測值進(jìn)行正態(tài)分布驗(yàn)證的條件下，通過空白樣本的檢測均值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差的和求得檢出限。由于低值標(biāo)本，尤其是濃度過低的空白樣本，儀器所報(bào)結(jié)果通常為0，其數(shù)據(jù)群是呈非正態(tài)分布的，因此上述方法統(tǒng)計(jì)結(jié)果不夠嚴(yán)謹(jǐn)，所得結(jié)果缺乏科學(xué)性。Rawlins等人[13]應(yīng)用工具軟件（EPEvaluatorRelease5software）分別評價(jià)了Access2,ADVIACentaur,AxSYM和E170檢測儀器的檢測低限，其評價(jià)ADVIACentaur的檢測低限為0.8pg/ml，本文結(jié)果顯示ADVIACentaur240BNP空白限及檢測低限分別是0.86pg/ml和1.47pg/ml,與國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道一致。通過與廠商聲明值比較，本研究結(jié)果均低于廠商聲明值，符合臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用要求。雖然在很多臨床實(shí)驗(yàn)室及診斷應(yīng)用中，檢測低限和空白限及生物檢測限和檢出限常互換使用，但對其之間的相互關(guān)聯(lián)以及相互區(qū)別并未作出詳細(xì)的介紹和研究。本實(shí)驗(yàn)對其各自的聯(lián)系和區(qū)別作了進(jìn)一步的探討和研究。發(fā)現(xiàn)使用發(fā)光強(qiáng)度值和濃度計(jì)算所得的檢測低限和空白限雖然均低于廠家聲明的檢測低限，但其檢測結(jié)果并不完全相同，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的空白限稍低于檢測低限；空白限選擇樣本重復(fù)檢測的次數(shù)越多，估計(jì)的LoD不確定度越小，檢測的結(jié)果就更可靠。對于生物檢測限和檢出限而言，雖然其結(jié)果比較相近，但生物檢測限卻只能確定在某一范圍之內(nèi)，如需進(jìn)一步確定其具體數(shù)值，其操作方法復(fù)雜繁瑣，而檢出限可以較簡單方便地計(jì)算出具體數(shù)值。EP-17A方案中，采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法來確定檢測結(jié)果，結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理科學(xué)合理。目前國內(nèi)分析報(bào)告結(jié)果常采用濃度值，而非原始的分析信號，EP-17A方案采用濃度計(jì)算，適用于所有實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行儀器分析靈敏度評價(jià)實(shí)驗(yàn)。如今，還有很多醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用不同方法對BNP的檢測限值進(jìn)行了評估和檢測儀器間的比較，所得結(jié)果也證實(shí)了自身檢測系統(tǒng)在BNP檢測的應(yīng)用價(jià)值[14]，但這些分析方法的結(jié)果并不完全一致，存在很多概念[5]和概念上的交叉，需要一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來規(guī)范性能評價(jià)方法。美國CLSIEP-17A文件對如何確定和驗(yàn)證空白限、檢出限提出了具體的要求并提供了具體的實(shí)驗(yàn)方法，有望成為靈敏度分析方法的標(biāo)準(zhǔn)。但是，在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)該文件存在一些局限性。比如測試數(shù)太多，成本比較高，并且規(guī)定在確定LoD時(shí)，低濃度樣品濃度范圍在LoB的1-4倍之間，沒有規(guī)定具體的濃度間距，這就對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成了影響。因?yàn)椴煌拈g距得到的LoD值存在差異，使各個(gè)實(shí)驗(yàn)室不能統(tǒng)一結(jié)果。故CLSIEP-17A文件需要進(jìn)一步的補(bǔ)充和完善。參考文獻(xiàn)［1］MorrowDA,CannonCP,JesseRL,etal.NationalAcademyofClinicalBiochemistryLaboratoryMedicinePracticeGuidelines:ClinicalCharacteristicsandUtilizationofBiochemicalMarkersinAcuteCoronarySyndromes[J].ClinChem2007,53［2］AppleFS,JesseRL,NewbyLK,etal.NationalAcademyofClinicalBiochemistryandIFCCCommitteeforStandardizationofMarkersofCardiacDamageLaboratoryMedicinePracticeGuidelines:AnalyticalIssuesforBiochemicalMarkersofAcuteCoronarySyndromes[J].ClinChem2007,53［3］AppleFS,WuAH,JaffeAS,etal.WuNationalAcademyofClinicalBiochemistryandIFCCCommitteeforStandardizationofMarkersofCardiacDamageLaboratoryMedicinePracticeGuidelines:AnalyticalIssuesforBiomarkersofHeartFailure[J].ClinBiochem2008,41:［4］中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會,中華心血管病雜志編輯委員會.急性心力衰竭診斷和治療指南[J].中華心血管病雜志,2010,38(3):195-208.［5］CLSIEP-17A.ProtocolsforDeterminationofLimitsofDetectionandLimitsofQuantitation;ApprovedGuideline[S].2004,1-39.［6］楊有業(yè),張秀明主編.臨床檢驗(yàn)方法學(xué)評價(jià)[M].人民衛(wèi)生出版社出版,2008:142-162.［7］張秀明,莊俊華,鄭松柏,等.臨床化學(xué)發(fā)光免疫法檢測AFP的分析性能驗(yàn)證與實(shí)驗(yàn)方法[J]