余甘子果實(shí)的抑菌活性研究

余甘子果實(shí)的抑菌活性研究

余甘子來自大石科植物。余甘子的化學(xué)成分比較多，含有VC、脂肪、蛋白質(zhì)、多酚、VE、鞣質(zhì)、黃酮、生物堿、氨基酸及各種微量元素等?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)余甘子具有廣泛的抗菌能力，余甘子果實(shí)浸出液對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、鼠沙門氏菌、霍亂弧菌、大腸埃希氏菌、酵母菌、須發(fā)癬菌和紅色癬菌均有抑(殺)菌效果。由于本實(shí)驗(yàn)主要研究該提取物是否可以用于食品防腐劑，因此只選擇乙醇溶劑對(duì)余甘子果實(shí)進(jìn)行粗提，研究該粗提物對(duì)食品中常見菌的抗菌譜和抗菌活性。1材料和方法1.1試劑與儀器余甘子果實(shí)購(gòu)于云南思茅。供試菌種由重慶工商大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)中心提供。95%乙醇(分析純)；葡萄糖(分析純)；蛋白胨；瓊脂；麥芽汁；牛肉膏；二甲基亞砜(DMSO)成都市科龍化工試劑廠；MTT染料(噻唑藍(lán)Tluka，用PBS-G配成1mg/ml,4℃避光保存)；其它試劑均為分析純。1.2汽滅菌器、蒸發(fā)儀器YXQ.SG41.280手提式壓力蒸汽滅菌器；SHA-C恒溫振蕩器；TDZ5-WS離心機(jī)；BC-R5001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；DNM-9602G酶標(biāo)儀。1.3方法1.3.1提取與干燥成粉末余甘子干果粉碎，過40目的孔篩，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器(不開真空泵)，用70%的乙醇分兩次提取，提取溫度50℃、時(shí)間4h。第一次用6倍體積的醇液提取，第二次用4倍體積的醇液提取。兩次提取液過濾合并，以3000r/min離心20min，上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至無醇味。浸膏用真空微波干燥器干燥成粉末。用二甲基亞砜(DMSO)溶解粗提物配成10%、1%和0.1%三個(gè)濃度梯度備用。1.3.2l0倍稀釋法配制培養(yǎng)基：分別對(duì)各菌種接種、常規(guī)培養(yǎng)至三代備用。取培養(yǎng)后的細(xì)菌原液，采用l0倍稀釋法稀釋，依次標(biāo)記為l0-1、l0-2、l0-3…l0-8，各濃度分別做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。采用平板菌落計(jì)數(shù)法，培養(yǎng)后計(jì)算各培養(yǎng)皿的菌落，得最佳供試菌液濃度為106CFU/ml。1.3.3含藥溶液的制備在無菌條件下，取106的菌懸液0.2ml涂布在凝固的平板表面，每個(gè)濃度的菌懸液做三個(gè)平行；分別取各個(gè)濃度的含藥溶液及二甲基亞砜(空白)2ml于滅菌培養(yǎng)皿中，放入直徑為5mm的中性濾紙片，浸泡4h，用無菌鑷子夾起濾紙片(按濃度從大到小)順時(shí)針貼在表面含菌的同一平板上，細(xì)菌37℃培養(yǎng)24h，酵母菌28℃培養(yǎng)24h，霉菌28℃培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)量抑菌圈的大小，計(jì)算平均值。1.3.4最低濃度實(shí)驗(yàn)MTT比色分析法的原理是利用活細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶，將染料MTT還原成不溶性的甲臜顆粒，按酸化異丙醇溶解甲臜顆粒所呈現(xiàn)的顏色深淺來反映細(xì)菌、酵母、霉菌的數(shù)量及代謝活躍程度。通過抑菌圈實(shí)驗(yàn)，選擇有較強(qiáng)抑菌作用的菌株做最低濃度實(shí)驗(yàn)。將96孔培養(yǎng)板經(jīng)紫外線消毒30min后，每排第1孔加入16%的DMSO溶解的提取液0.1ml，依次加入2倍稀釋度的提取物溶液至第9孔，各孔均以菌懸液(106CFU/ml)補(bǔ)充至0.2ml，第10孔作為對(duì)照，做三個(gè)平行。將細(xì)菌培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h，酵母菌于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h，然后每孔加入MTT液50μl，再培養(yǎng)1～4h，當(dāng)培養(yǎng)板底微顯藍(lán)色顆粒物樣時(shí)，3000r/min離心10min，吸取上清液，加入酸化異丙醇100μl，振蕩1min，在570/630nm處比色，按下式計(jì)算抑菌百分率(A)。2結(jié)果與分析2.1提取物的制備余甘子果實(shí)1kg粉碎后，過40目孔篩，用70%乙醇(10L)、轉(zhuǎn)速50r/min、50℃浸提4h，合并提取液，離心分離，回收溶劑至無醇味，真空微波干燥得到提取物粉末317g，得率為31.7%。2.2余甘子的抑菌活性實(shí)驗(yàn)用的濾紙片是由直徑為5mm的打孔器制成的，當(dāng)抑菌圈接近5mm時(shí)，可以認(rèn)為不抑菌，結(jié)果見表1。從表1可以看出，實(shí)驗(yàn)中采用的余甘子果實(shí)提取的濃度范圍內(nèi)對(duì)黑曲霉、青霉、黑根霉沒有抑菌活性?？紤]到提取物要在食品中使用，選取較大的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)意義不大，所以最大濃度只選擇了10%。2.3抑菌活性的測(cè)定是最低抑菌濃度的概念從表2看出，余甘子果實(shí)粗提物對(duì)啤酒酵母有一定的抑菌作用，但抑菌活性不是很強(qiáng)，在三個(gè)濃度梯度中，只有10%的供試液有抑菌活性，而1.0%和0.1%的供試液沒有抑菌活性，這是由于供試液濃度未達(dá)到最低抑菌濃度值。2.4抑菌活性的比較從表3看出，提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、變形桿菌的抑制活性非常強(qiáng)，尤其是對(duì)嗜熱脂肪芽孢桿菌的作用最強(qiáng)，除了10%的供試溶劑有作用外，1%提取物也有作用，只是抑制活性沒有前者強(qiáng)。2.5抑菌圈法的最優(yōu)抑菌率通過MTT微量法快速測(cè)定余甘子粗提物對(duì)嗜熱脂肪芽孢桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和啤酒酵母的抑制作用，結(jié)果如圖1所示。MTT法顯示的結(jié)果和濾紙片抑菌圈法的結(jié)果有很好的同一性，即抑制作用大小為：嗜熱脂肪芽孢桿菌>變形桿菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>枯草芽孢桿菌。如果以100%的抑菌率為完全抑菌，90%以上的抑菌率為具有抑菌作用，則余甘子提取物對(duì)嗜熱脂肪芽孢桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的最小完全抑菌濃度為4.0%、4.0%、4.0%、8.0%、8.0%。最小抑菌濃度為2.0%、2.0%、2.0%、4.0%、4.0%。啤酒酵母的最小完全抑菌濃度為16.0%，最小抑菌濃度為8.0%。3芽孢桿菌的抑菌效果通過余甘子果實(shí)粗提物對(duì)9株細(xì)菌、3株霉菌、1株啤酒酵母菌的抑菌實(shí)驗(yàn)可知，粗提物對(duì)霉菌沒有抑菌活性；對(duì)啤酒酵母有一定的抑菌活性，但活性不強(qiáng)；對(duì)9株細(xì)菌都有一定的抑制作用，但對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌、蘇云金桿菌、產(chǎn)氣夾膜桿菌、綠膿桿菌的作用效果不明顯，對(duì)另外5種細(xì)菌的抑菌效果明顯，1%濃度的提取物也有一定的活性，抑制作用強(qiáng)弱順序