牛體外受精技術(shù)胚胎應(yīng)用效果的比較研究

牛體外受精技術(shù)胚胎應(yīng)用效果的比較研究

1982年，brackt等人首次報(bào)道了世界上第一個(gè)移動(dòng)基因（ivf）牛，引起了生物科學(xué)家的高度興趣。特別是牛外科技術(shù)的發(fā)展迅速，理論和方法也更加成熟和完善。它是動(dòng)物胚胎工程的基礎(chǔ)和重要研究分支，在20世紀(jì)80年代末開(kāi)始開(kāi)發(fā)。在中國(guó),家畜繁殖技術(shù),尤其是牛的胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)發(fā)展很快,已初步具備產(chǎn)業(yè)化條件,發(fā)展前景廣闊(王新武,2002)。牛擴(kuò)繁產(chǎn)業(yè)化的技術(shù)分為體內(nèi)胚生產(chǎn)和體外胚生產(chǎn)。體內(nèi)胚生產(chǎn)即用常規(guī)的人工授精方法進(jìn)行配種,而體外胚生產(chǎn)即體外授精技術(shù)。胚胎的體外生產(chǎn)技術(shù)包括超聲監(jiān)視下活體取卵(ovumpickup,OPU)、體外成熟、體外授精、體外培養(yǎng)及性別控制/性別鑒定等技術(shù)(張忠誠(chéng),2002),而性控胚技術(shù)的目的是獲得大量?jī)?yōu)良遺傳性狀并已知性別的胚胎,用于胚胎移植,以快速獲得良種牛群。OPU技術(shù)與IVF技術(shù)的有機(jī)結(jié)合不僅加快了優(yōu)秀個(gè)體的繁殖速度,同時(shí)也解決了體外授精技術(shù)優(yōu)秀卵母細(xì)胞的來(lái)源和胚胎系譜的問(wèn)題(Pieterse等,1991),但是,IVF胚胎的質(zhì)量是否與體內(nèi)胚胎相當(dāng)也一直飽受爭(zhēng)議。作者對(duì)IVF胚胎與體內(nèi)胚胎的移植妊娠率及出生后牛的性別比例、性控IVF與非性控IVF胚胎的囊胚發(fā)育率進(jìn)行了比較,對(duì)性控IVF及非性控IVF的胚胎進(jìn)行了性別鑒定,以期為性別控制胚胎擴(kuò)繁技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的推廣應(yīng)用提供參考。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1卵母細(xì)胞卵母細(xì)胞由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳研究所松江實(shí)驗(yàn)基地提供。1.1.2西5.出/建筑節(jié)能型非性控精液購(gòu)自上海奶牛育種中心,公牛號(hào):30201,批號(hào):20050312;性控精液購(gòu)自大慶市田豐生物工程公司,公牛號(hào):02129,批號(hào):20050505。1.1.3資料與實(shí)驗(yàn)材料卵母細(xì)胞成熟液IVMD-101、受精液IVF-100均購(gòu)自日本IFP;胚胎培養(yǎng)液ACM為上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所克隆實(shí)驗(yàn)室配制(李曉晨等,2009)。其余試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。1.2測(cè)試方法1.2.1卵丘細(xì)胞的培養(yǎng)在超聲儀監(jiān)視下活體取卵,取出卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)放入成熟液(IVMD-101)中,5%CO2,38.5℃,飽和濕度下培養(yǎng)22～24h,將成熟的卵母細(xì)胞在受精液(IVF-101)中洗滌多次,去除多余的卵丘細(xì)胞,使卵母細(xì)胞周?chē)Ａ?～3層的卵丘細(xì)胞。1.2.2受香精液處理非性控精液和性控精液均分別使用同一個(gè)體公牛的同一批號(hào)凍精。37℃水浴迅速解凍精液,將解凍后的精子置于3mL左右的受精液中,輕柔混勻后,2500r/min離心5min,棄去上清液,加入3mL受精液,輕柔混勻,以相同轉(zhuǎn)速和時(shí)間再離心1次,棄去上清,用1mL左右受精液重懸沉淀。1.2.3精子與卵母細(xì)胞的培養(yǎng)調(diào)整精子終濃度在2×106～3×106/mL(性控精液精子終濃度控制為4×106～5×106/mL),精子與卵母細(xì)胞于5%CO2、38.5℃、飽和濕度下共培養(yǎng)6～7h。將受精卵放入上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所克隆實(shí)驗(yàn)室自配的ACM培養(yǎng)液中于5%CO2、38.5℃、飽和濕度下培養(yǎng)。受精后48h統(tǒng)計(jì)卵裂率,第8天統(tǒng)計(jì)囊胚率。1.2.4麻醉后體移植將裝有胚胎的移植管裝入移植套管再裝入移植槍內(nèi),移植套膜套在最外層,將受體母牛站立保定,用1mL麻醉劑“864”肌注及2mL利多卡因尾椎硬膜外麻醉,清除直腸糞便,消毒外陰后,將移植槍緩慢推至子宮角處進(jìn)行胚胎移植。受體母牛移植60d后仍未返情,則通過(guò)直腸觸診診斷受孕情況。1.2.5胚胎的性別鑒定將冷凍管(裝有1枚胚胎,培養(yǎng)液約10μL,)解凍,胚胎吹入洗滌小皿,在PBS液中洗3次,然后分別將1枚胚胎吸入1個(gè)PCR管中,立即加去離子水10μL、95℃加熱裂解10min,之后用PCR擴(kuò)增進(jìn)行胚胎的性別鑒定。1.2.6sry基因核心序列根據(jù)牛基因組特異性DNA序列和Y染色體的性別決定區(qū)(SRY)核心序列設(shè)計(jì)PCR引物(表1)。內(nèi)源對(duì)照特異性引物:采用引物YY1、YY2,反應(yīng)體積25μL,包含DNA2.5μL(鑒定的1枚囊胚的裂解DNA于10μL水中)。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min;94℃變性45s,55℃退火30s,72℃延伸1min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。SRY基因核心序列特異引物:第一次擴(kuò)增:引物C1、C2,反應(yīng)體積25μL,包含DNA2.5μL。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min;94℃變性45s,55℃退火30s,72℃延伸1min,20個(gè)循環(huán)。第二次擴(kuò)增:引物C2、C3,反應(yīng)體積25μL(含第一次擴(kuò)增產(chǎn)物10μL)。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min;94℃變性45s,55℃退火30s,72℃延伸1min,35個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物15μL,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),EB染色顯影并拍照。1.2.7統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異顯著。2結(jié)果與分析2.1民法上的受體民法選擇同步發(fā)情處理的母牛作為移植胚胎受體母牛,每頭受體牛移植一枚IVF囊胚,共移植了30頭受體母牛,同時(shí)用人工受精的69頭受體母牛作為對(duì)照。移植60d后經(jīng)直腸觸診診斷,結(jié)果顯示,IVF組有12頭受體母牛懷孕,妊娠率為40.0%;體內(nèi)胚胎組有28頭受體母牛懷孕,妊娠率為40.6%,兩組妊娠率無(wú)顯著性差異(P=0.957)(表2)。2.2工駝峰試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)用Y染色體的性別決定區(qū)(SRY)核心序列進(jìn)行PCR,對(duì)牧場(chǎng)普通人工受精及普通IVF的試驗(yàn)牛作了性別比例統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示,兩者的公牛比例分別為51.7%與66.7%(P=0.041)(表3),存在顯著性差異(P<0.05),即普通IVF出生的公牛比例明顯高于常規(guī)人工受精。2.3普通iiif胚胎與性控不同性別比例通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法對(duì)普通IVF胚胎與性控IVF胚胎進(jìn)行了性別鑒定,結(jié)果顯示,普通IVF胚胎公牛比例(60.9%)顯著高于性控IVF胚胎的公牛比例(11.5%)(P<0.0001)(表4)。2.4顯著性差異檢驗(yàn)普通精液IVF胚胎卵裂率為73.1%±3%,性控精液IVF卵裂率為57.7%±10%(P=0.001),存在顯著性差異;然而普通精液IVF囊胚率與性控精液IVF囊胚率分別為40.4%±13%與36.6%±8%,無(wú)顯著性差異(P=0.530)(表5)。3擴(kuò)繁性別控制技術(shù)由于傳統(tǒng)育種方式周期長(zhǎng)、速度慢,無(wú)法滿足國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展及人民日益增長(zhǎng)的物質(zhì)需求,因此,體外受精性控胚擴(kuò)繁技術(shù)能夠加快優(yōu)質(zhì)奶牛群的建立,是迅速擴(kuò)大良種畜群的有效手段之一。本研究比較了IVF胚胎與體內(nèi)胚胎的妊娠率,結(jié)果顯示,IVF胚胎移植妊娠率與體內(nèi)胚胎妊娠率無(wú)顯著性差異,證實(shí)IVF胚胎與體內(nèi)胚胎的質(zhì)量相當(dāng)。另外,研究結(jié)果表明,IVF胚胎基本保持了正常胚胎的基因特性(Smith等,2009)。因此,應(yīng)用良種牛IVF胚胎可提高牛肉、奶類的產(chǎn)量和品質(zhì),有著顯著效果和重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,而通過(guò)OPU技術(shù)取卵可大大降低生產(chǎn)成本,這是傳統(tǒng)體內(nèi)胚胎所無(wú)法比擬的,而且由于全部程序均在體外操作完成,這為IVF牛胚胎的大批量生產(chǎn)達(dá)到產(chǎn)業(yè)化規(guī)模提供了更廣闊的發(fā)展空間。在胚胎產(chǎn)業(yè)化中,為了充分發(fā)揮母畜的繁殖潛力和公畜的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),進(jìn)而提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益,排除畜群中有害基因和基因型,防止性連鎖疾病,提高優(yōu)良畜群的繁殖速度,研究者一直在進(jìn)行控制家畜性別的研究(Underwood等,2010;Hochman等,1996;Palma等,2004)。目前對(duì)家畜性別的控制主要有兩種方式,一是應(yīng)用性控精液(Palma等,2008),二是進(jìn)行早期胚胎的性別鑒定(曾溢滔等,1993)。本研究統(tǒng)計(jì)了牧場(chǎng)人工受精出生牛及普通IVF出生牛的性別比例,結(jié)果發(fā)現(xiàn),常規(guī)普通精液人工受精出生牛及普通IVF出生牛的公牛比例分別為51.7%、66.7%,說(shuō)明IVF的公牛明顯高于理論值(50%);采用性控和非性控精液進(jìn)行IVF試驗(yàn),并應(yīng)用PCR擴(kuò)增牛SRY核心序列進(jìn)行奶牛胚胎性別鑒定,說(shuō)明普通IVF胚胎公牛的比例達(dá)60.9%,同樣高于理論值(50%);而用性控精液進(jìn)行IVF胚胎的公牛比例為11.5%,即性控IVF胚胎的公牛比例比普通IVF胚胎的公牛