生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-實(shí)驗(yàn)三-PCR_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

PCR擴(kuò)增目的DNA片段聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）是1985年由KaryMullis發(fā)明的。

DNA的復(fù)制(replication)

——

由親代DNA合成兩個(gè)相同的子代DNA的過(guò)程。

復(fù)制親代DNA子代DNA

一、PCR的基本原理變性退火延伸72℃Taq聚合酶是一種耐熱的DNA聚合酶，由于發(fā)現(xiàn)于水生棲熱菌（Thermusaquaticus）內(nèi)，故命名為T(mén)aq聚合酶（Taqpolymerase），也稱(chēng)為T(mén)aqDNA聚合酶，簡(jiǎn)稱(chēng)Taq酶或Taq。DNA模板95℃（解鏈）60℃（退火）與引物結(jié)合72℃（延伸）DNA單鏈引物Taq酶，dNTPs,Mg2+模板、引物、4種dNTP和耐熱DNA聚合酶存在的條件下，特異擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段

的酶促合成反應(yīng)。二、操作步驟：（以3－磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因的擴(kuò)增為例,目標(biāo)片段815bp）1、PCR體系ReagentsVolume(ul)ddH2O（DEPC）2.5PCRBuffer2.5Mg2+2.5dNTPs 2.5GAPDHprimerF2.5GAPDHprimerR2.5Taqpolymerase2.5cDNAtemplate2.5Totalvolume20瞬時(shí)離心后2、反應(yīng)條件：預(yù)熱：95℃3min；

解鏈：95℃30s；

退火：60℃30s；28個(gè)循環(huán)

延伸：72℃45s；

再延伸：72℃5min；

保存：12℃99min3、準(zhǔn)備1%瓊脂糖凝膠4、加樣：延伸完畢后即可取出樣品，取8ulPCR產(chǎn)物加入2ul6×loadingbuffer于新的一支0.5ml的Ep管中，瞬時(shí)離心后，加入10ul樣品到瓊脂糖凝膠中。（ps:剩余PCR產(chǎn)物保留至下一酶切實(shí)驗(yàn)用）MS5、電泳：

120V,電泳20min6、染色：

EB染3min，自來(lái)水清洗一次7、觀察：凝膠成像系統(tǒng)照相

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