dhea法與雌激素聯(lián)合hcg法建立的多囊卵巢綜合征大鼠模型

dhea法與雌激素聯(lián)合hcg法建立的多囊卵巢綜合征大鼠模型

多囊卵巢綜合征（pco綜合征）是發(fā)育期婦女常見的繁殖疾病。其特點(diǎn)是卵巢強(qiáng)度障礙、高雄激素血癥和多囊卵巢囊腫。通常從青春期開始發(fā)病，發(fā)病率約為6%10%。臨床癥候具有高度異質(zhì)性,不同患者的病理生理特征差異較大,發(fā)病機(jī)制不清,患者主要以藥物治療為主,臨床標(biāo)本獲取較困難,故對其發(fā)病機(jī)制及治療機(jī)制的人體研究存在諸多局限,尋找理想的接近人類PCOS病理特征的動物模型對深入研究PCOS的發(fā)生發(fā)展及治療有深遠(yuǎn)意義。本研究對孕激素聯(lián)合人絨毛膜促性腺激素(hCG)法以及脫氫表雄酮(DHEA)法2種方法構(gòu)建的PCOS大鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,以期為后續(xù)研究提供適宜的動物模型。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動物SPF級21日齡Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠120只(購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心),體重45～55g。1.1.2諾酮硅膠棒DHEA粉劑(施瑞科技);左旋18-甲基炔諾酮硅膠棒(上海達(dá)華制藥);注射用hCG(麗珠制藥);大鼠胰島素檢測酶免(ELISA)試劑盒(廣州達(dá)瑞抗體工程技術(shù)有限公司)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1模型大鼠b.孕棒的模型評價120只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為4組:模型組I、II各44只,對照組Ⅰ、Ⅱ各16只。模型組Ⅰ大鼠于24日齡5%利多卡因局麻后,股部內(nèi)側(cè)皮埋避孕棒,每只3～4mm。對照組Ⅰ不予處理;于27日齡時,模型組Ⅰ大鼠開始頸背部皮下注射hCG1.5×103U/L和0.2ml生理鹽水,對照組Ⅰ大鼠皮下注射生理鹽水0.2ml;連續(xù)用9d后停藥。模型組Ⅱ大鼠于24日齡時開始,每天頸背部皮下注射DHEA3mg/100g和0.2ml注射用油劑,對照組Ⅱ大鼠皮下注射注射用油劑0.2ml;連續(xù)注射20d后停藥。停藥后,連續(xù)陰道涂片7d,觀察陰道上皮周期性變化,初步判斷建模是否成功。1.2.2血清狀態(tài)及指標(biāo)檢測①從大鼠陰道口開放日齡起,每日8:00及20:00觀察并記錄大鼠陰道口開放情況;②動情周期變化,陰道涂片并濕片觀察陰道脫落細(xì)胞形態(tài)變化;③相關(guān)指標(biāo)檢測:模型組Ⅰ大鼠在42日齡、模型組Ⅱ大鼠在51日齡、對照組大鼠在陰道涂片示動情間期時,晚8:00禁食,次日晨8:00稱重。腹腔注入10%水合氯醛麻醉,腹主動脈取血5～8ml。靜置0.5h后將全血3000rpm/min離心10min得血清。血糖儀測定空腹血糖值(FPG);大鼠胰島素ELISA試劑盒測定空腹血清胰島素水平(FINS);血清雌二醇(E2)、睪酮(T)、孕酮(P)采用微粒子酶免分析法測定。按照公式計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評估(HOMA)指數(shù)=FINS(mμ/L)×FPG(mmol)/22.5;④卵巢形態(tài)學(xué)觀察,在采血同時各組另取大鼠解剖雙側(cè)卵巢,盡量分離去除卵巢周圍脂肪組織,濾紙包裹后迅速置于電子天平稱其濕重,計(jì)算卵巢指數(shù)(OC,表示卵巢組織的單位重量);甲醛固定稱量后的卵巢,石蠟包埋切片,HE染色。1.3統(tǒng)計(jì)方法數(shù)值變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)(xˉ±s)表示,所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件分析,組間比較采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1模型組和對照組的選取模型組Ⅰ為31±3d,對照組Ⅰ為36±2d;模型組Ⅱ?yàn)?7±2d,對照組Ⅱ?yàn)?5±2d。模型組大鼠陰道口開放日齡均早于對照組(t=2.534,P<0.001)。2.2主2轉(zhuǎn)移間期模型組Ⅰ中38只大鼠、模型組Ⅱ中34只大鼠連續(xù)陰道涂片觀察顯示持續(xù)處于動情間期,提示無排卵。兩對照組顯示有規(guī)律的動情周期,兩模型組失去規(guī)律動情周期的大鼠的比例分別為86.4%和77.3%(P<0.05),模型組Ⅰ建模成功率高于組Ⅱ,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.3對照組p>0.05模型組I體重、卵巢濕重、卵巢指數(shù)等均高于對照組(P<0.05);而模型組Ⅱ體重較對照組明顯減輕,但解剖發(fā)現(xiàn)其卵巢重量及卵巢指數(shù)均高于對照組(P<0.05),見表1。2.4iii血清統(tǒng)一血清的i、e、p、t水平比較模型組I血清P、T水平較對照組升高(P<0.05),但E2水平與對照組相差不大。模型組II血清E2、P、T水平均較對照組高(P<0.05)。兩種建模方法顯示FPG、FINS及HOMA指數(shù)均高于相應(yīng)對照組,兩模型組行兩樣本t檢驗(yàn),血清E2、P水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),余指標(biāo)無明顯差異,見表2。2.5關(guān)于海南島的形態(tài)2.5.1一般形狀對照組卵巢色澤紅潤,卵巢表面多個黃體;模型組卵巢表面蒼白,體積增大,卵巢表面多個擴(kuò)張的透明囊泡。2.5.2黃松砂模型的成分模型組Ⅰ(圖1)光鏡下見多個擴(kuò)張的囊泡,閉鎖卵泡常見,囊泡內(nèi)卵母細(xì)胞或放射冠消失,顆粒細(xì)胞層數(shù)減少(2～3層),排列疏松,極少見黃體形成;模型組Ⅱ(圖2)中見多個擴(kuò)張的囊泡,顆粒細(xì)胞疏松,可見黃體組織;對照組(圖3、4)大鼠卵母細(xì)胞清晰,顆粒細(xì)胞層數(shù)多(6～10層),排列緊密,有黃體形成。3妊娠合并心臟病模型構(gòu)建因大鼠有較穩(wěn)定的動情周期,利用其開展實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)濟(jì)方便,一直是PCOS建模的首選。PCOS動物模型的建模方法眾多,如雄激素建模法、雌激素建模法、孕激素聯(lián)合hCG建模法、胰島素聯(lián)合hCG建模法、芳香化酶抑制劑建模法及近年來雄激素聯(lián)合hCG建模法等。本實(shí)驗(yàn)從中選取了目前較為公認(rèn)的兩種方法進(jìn)行了驗(yàn)證和比較。目前普遍認(rèn)為下丘腦-垂體-卵巢(HPO)軸功能紊亂導(dǎo)致的促性腺激素(Gn)分泌異常,主要是黃體生成激素(LH)分泌增加,是PCOS發(fā)病的中間環(huán)節(jié)。LH與高雄激素血癥、胰島素抵抗等典型PCOS的病理生理變化均密切相關(guān)。早在1989年BogovichK就提出孕激素聯(lián)合hCG建模法。其機(jī)制是皮下埋植緩釋孕激素避孕劑左旋18-甲基炔諾酮抑制HPO軸,使性激素分泌呈低水平,導(dǎo)致不排卵。而hCG發(fā)揮類LH的作用,在卵泡早期使用致卵泡閉鎖,故孕激素聯(lián)合使用hCG可構(gòu)建PCOS動物模型。大量臨床研究發(fā)現(xiàn),PCOS多起病于女性的圍初潮期。青春發(fā)育前2年,腎上腺重量及腎上腺皮質(zhì)厚度增加,腎上腺雄激素合成分泌增多,臨床上表現(xiàn)為血清DHEA和硫酸脫氫表雄酮(DHEAS)水平顯著升高,促進(jìn)了伴有腎上腺源性雄激素升高的PCOS的發(fā)生。在此理論基礎(chǔ)上,1991年Lee等首先用DHEA成功構(gòu)建了類PCOS模型,機(jī)理為:DHEA是孕烯醇酮經(jīng)△5途徑轉(zhuǎn)化為雄烯二酮的中間產(chǎn)物,該途徑受LH的調(diào)節(jié)。通過外源性途徑提高DHEA水平造成雄烯二酮水平增高,進(jìn)而睪酮及雌酮水平升高,造成PCOS高雄激素血癥,升高的雌酮水平對FSH負(fù)反饋使促卵泡素(FSH)相對不足,卵泡發(fā)育停滯,從而導(dǎo)致排卵障礙及卵巢多囊改變。有學(xué)者提出PCOS“青春期發(fā)育亢進(jìn)學(xué)說”,假性性早熟已被確定為兒童日后發(fā)展成PCOS的危險(xiǎn)因素之一。故以剛離乳SD大鼠作為研究對象的建模方法更符合臨床實(shí)際而受到研究者的推崇,本實(shí)驗(yàn)也選取剛離乳的幼齡SD大鼠開始建模。研究結(jié)果顯示,兩種方法建立的PCOS模型與對照組相比,在青春期表現(xiàn)出早熟、高雄激素、胰島素抵抗及卵泡大量閉鎖卵巢多囊性改變等,基本具備了臨床PCOS患者基本的病理生理學(xué)特征。本研究顯示,孕激素聯(lián)合hCG建模法采用皮下埋植孕激素避孕棒緩慢而穩(wěn)定地釋放孕激素,用生理鹽水溶解hCG皮下注射,方法簡便易于操作,建模周期較短。DHEA因其不溶于水配制成油劑,注射后短期內(nèi)很難完全吸收,吸收率的差異會影響大鼠建模成功率的高低,國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)各種指標(biāo)存在較大差異。本實(shí)驗(yàn)在實(shí)際操作中出現(xiàn)DHEA粉劑不易溶解,注射油劑時較困難,注射部位局部皮膚出現(xiàn)硬結(jié)影響藥物吸收等問題,較難操作,且相比孕激素聯(lián)合hCG建模所需時間長。孕激素聯(lián)合hCG建模組大鼠表現(xiàn)為明顯的肥胖,血清E2呈低水平,而DHEA建模組未出現(xiàn)明顯的肥胖,相反還出現(xiàn)了體重較對照組減輕,E2水平也高于對照組,與臨床PCOS表現(xiàn)不同。這些結(jié)果說明,避孕硅膠棒聯(lián)合hCG建模組大鼠的形態(tài)學(xué)和內(nèi)分泌學(xué)改變都與PCOS患者極為相似,是較為理想的PCOS動物模型。本研究結(jié)果與桂文武等、朱亮等、夏燕等的結(jié)果較吻合。結(jié)合實(shí)際應(yīng)用,由于所用避孕棒長期而持續(xù)地釋放孕激素抑制HPO軸,一方面模型的持續(xù)時間長,可用于做藥物療效的長