生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-第三次(PCR 蛋白純化)

PCR技術(shù)PCR:PolymeraseChainReaction(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))一）Concept——PolymeraseChainReactionPCR技術(shù)：在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的一種DNA快速擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法。1983

美國(guó)Cetus公司的KaryMullis于12月16日第一次成功實(shí)驗(yàn)發(fā)明了PCR；1985

關(guān)于PCR的文章首次由KaryMullis及其同事等人在《Science》上發(fā)表；1989

美國(guó)《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年；1993KaryMullis，NobelPrizeinChemistry；——PCR技術(shù)讓DNA的研究得到飛躍發(fā)展！1983年4月美國(guó)Cetus公司的KaryMullis開始設(shè)想二）PCR的發(fā)明1944~KaryMullisATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶1.體內(nèi)DNA的復(fù)制過程：三）PCR技術(shù)的原理及反應(yīng)步驟：DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’GGAUCG5’引物酶AUCGCG5’引物酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)1.體內(nèi)DNA的復(fù)制過程：ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’GGAUCG5’AUCGCG5’3’3’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)ATAGCGTAGCTGCGAGGATCGDNA聚合酶TAGCGCTATCGCATCGACGCTDNA聚合酶TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’AUCGCG5’3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’GGAUCG5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCT1.體內(nèi)DNA的復(fù)制過程：2.PCR反應(yīng)體系1）模板DNA2）特異引物3）耐熱DNA聚合酶4）dNTPs（包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP）5）含Mg+的緩沖液第一步——雙鏈DNA完全變性為單鏈DNA（95℃）－denature(變性)3.PCR反應(yīng)過程模板DNA第二步——降溫使引物與模板結(jié)合形成模板－引物復(fù)合物（50～65℃）－annealing(退火)模板DNA模板DNA引物引物第三步（72℃）DNA模板--引物結(jié)合物在

DNA聚合酶的作用下，以dNTPs為反應(yīng)原料合成一條新的與模板DNA互補(bǔ)的鏈。－elongation(延伸)耐熱DNA聚合酶dNTPs模板DNA引物模板DNA引物第一個(gè)循環(huán)－靶序列完成復(fù)制新的DNA新的DNA72℃95℃50-65℃反復(fù)循環(huán)25-40次變性解鏈退火(復(fù)性)新鏈合成引物耐熱DNA聚合酶+dNTPs

循環(huán)次數(shù)DNA的鏈數(shù)

1

2122

2243

23810

210102420

220

1,048,57630

230

1,073,741,82410億

PCR循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)量關(guān)系每完成一個(gè)循環(huán)需1～3分鐘，1～2小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。Mg2+dCTPdGTPdTTPdATPTaqDNA聚合酶

Primer4.PCR結(jié)果分析：四）PCR技術(shù)的特點(diǎn)：1.高度的靈敏性PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)230個(gè)拷貝1）皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平2）能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞3）細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2.特異性引物引物

(1)引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。

(2)引物設(shè)計(jì)的最大原則:是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。NOTE:3.對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。4.操作簡(jiǎn)便易行1）一次性加好反應(yīng)液，2～4小時(shí)完成擴(kuò)增2）擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析瓊脂糖凝膠電泳五）主要PCR類型：常規(guī)PCR技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription,RT-PCR)技術(shù)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原位PCR技術(shù)多重PCR技術(shù)……….六）PCR技術(shù)的應(yīng)用1.基因克隆可通過PCR技術(shù)克隆基因組中

的任一基因。2.臨床診斷細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測(cè)，遺傳病診斷等3.基因定點(diǎn)突變可利用PCR技術(shù)隨意在體外對(duì)目的基因片段進(jìn)行插入、缺失和點(diǎn)突變改造。4.法醫(yī)學(xué)鑒定親子鑒定，犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析5.DNA序列測(cè)定擴(kuò)增目的片段后可裝入特定的載體或直接測(cè)序。其他……凡是生命科學(xué)領(lǐng)域，PCR都有用武之地！小結(jié)一）PCR的概念二）PCR的發(fā)明三）PCR技術(shù)的原理及反應(yīng)步驟四）PCR技術(shù)的特點(diǎn)五）主要PCR類型六）PCR技術(shù)的應(yīng)用SeparationandPurificationofProtein蛋白質(zhì)的分離和純化蛋白質(zhì)是一生物大分子，要研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功能和利用，首先需要得到純的、沒有變性的蛋白質(zhì)樣品。

分離和純化蛋白質(zhì)的各種方法主要是利用蛋白質(zhì)之間各種特性的差異，包括：1.分子的大小和形狀2.酸堿性質(zhì)3.溶解度4.吸附性質(zhì)5.對(duì)配體分子的特異生物學(xué)親和力1.分段鹽析蛋白質(zhì)的鹽析（saltingout/saltprecipitation）采用中性鹽使混合物中不同蛋白質(zhì)析出沉淀下來(lái)的分離方法。

機(jī)制：

1.中和蛋白質(zhì)表面電荷2.與蛋白質(zhì)直接爭(zhēng)奪水化膜，致使蛋白質(zhì)水化膜破壞一、蛋白分離常用的中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等。鹽析時(shí)，溶液的pH在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處效果最好。鹽析沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，通常不會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性。血清蛋白球蛋白白蛋白α1-球蛋白α2-球蛋白β-球蛋白γ-球蛋白[飽和(NH４)２SO４][半飽和(NH４)２SO４][33%(NH４)２SO４]——分段鹽析法分段鹽析法：改變中性鹽的濃度/pH可使不同的蛋白質(zhì)分批分次沉淀下來(lái)的過程。2．有機(jī)溶劑沉淀分離法與水互溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低，引起蛋白質(zhì)沉淀。機(jī)制——改變了介質(zhì)的介電常數(shù)。水是高介電常數(shù)物質(zhì)(20℃時(shí)，80)有機(jī)溶劑是低介電常數(shù)物質(zhì)(20℃時(shí)，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4)因此有機(jī)溶劑的加入使水溶液的介電常數(shù)降低。蛋白質(zhì)分子表面水化膜破環(huán)促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。3.電泳分子大小不同的蛋白質(zhì)所帶電種類不同，凈電荷不同，遷移率不同，因此，在電泳時(shí)可以分開。1）．密度梯度(區(qū)帶)離心蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心;質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快;每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成獨(dú)立的區(qū)帶，4.離心蛋白質(zhì)在離心力場(chǎng)中的沉降行為用沉降系數(shù)表示(sedimentationcoefficient,S)，即每單位引力場(chǎng)生物大分子下沉的速度。

利用蛋白質(zhì)顆粒沉降行為不同可進(jìn)行超速離心分離S與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān)。

2）．超速離心4.離心

超速離心法(ultracentrifugation)

在超速離心機(jī)中，利用蛋白質(zhì)密度的不同，應(yīng)用強(qiáng)大的離心力（≥80000轉(zhuǎn)/分或500000×g）分離、制備、分析蛋白質(zhì)的方法。超速離心也可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量，對(duì)于球狀蛋白質(zhì)，其分子量與其沉降系數(shù)S成正比。=S未知S標(biāo)準(zhǔn)S未知Mr未知Mr標(biāo)準(zhǔn)二、蛋白純化

透析(dialysis)：是利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無(wú)機(jī)鹽、單糖等分開。常用的半透膜是玻璃紙和其他改型的纖維素材料。1．透析

超濾：是利用壓力或離心力，強(qiáng)行使水和其他小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽的目的。2.超濾：親和層析離子交換層析凝膠過濾層析3．層析1）．凝膠過濾層析(分子排阻)3．層析2）.離子交換層析（IonExchangeChromatography，IEC）：——離子交換劑（陽(yáng)離子/陰離子）——液體固定相：流動(dòng)相：離子交換層析原理：利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)(活性基團(tuán))對(duì)溶液中各種離子的結(jié)和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離技術(shù)。以陽(yáng)離子交換層析為例，陽(yáng)離子交換樹脂顆粒上帶負(fù)電荷，能吸收溶液中的正離子，再用含陽(yáng)離子的溶液洗柱，含正電荷少的蛋白質(zhì)先被洗下來(lái)，增加陽(yáng)離子濃度，含正荷量多的蛋白質(zhì)也被洗脫下來(lái)，從而達(dá)到分離的目的。原理：親和層析(affinit