水稻籽實(shí)中砷的結(jié)合形態(tài)及其穩(wěn)定性研究

水稻籽實(shí)中砷的結(jié)合形態(tài)及其穩(wěn)定性研究

1人體害作用元素由于礦工活動(dòng)和植物環(huán)境中添加量的逐年增加，食物和其他農(nóng)產(chǎn)品中的as污染日益嚴(yán)重。因此，人類(lèi)經(jīng)常將as作為食物攝入中毒的例子。根據(jù)研究，as是一個(gè)對(duì)動(dòng)植物具有強(qiáng)烈毒性的因素，可能會(huì)導(dǎo)致各種人類(lèi)疾病和致癌性疾病。as的毒性與存在形式密切相關(guān)。海產(chǎn)石油通常擁有大量as，國(guó)外對(duì)as的分布和組合進(jìn)行了研究。谷物是人們的主要食物。它在國(guó)內(nèi)外對(duì)重金屬cd、pb和其他元素的結(jié)合形態(tài)進(jìn)行了研究，但糧食和其他作物籽中as的存在形式和毒性沒(méi)有系統(tǒng)的研究。作者在水稻果實(shí)中研究了as的分布、加工過(guò)程中的去除及其存在形態(tài)。結(jié)果表明，谷物中的as主要與蛋白質(zhì)結(jié)合。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步研究了水稻果實(shí)中蛋白質(zhì)-as的結(jié)合形態(tài)特征及其穩(wěn)定性，為評(píng)估動(dòng)物和人類(lèi)的毒性提供了科學(xué)依據(jù)。2材料和方法2.1試驗(yàn)樣本試驗(yàn)所選用的水稻籽實(shí)采自湖北省大冶銅礦地區(qū)附近的污染農(nóng)田,糙米中As的濃度為0.685μg·g-1.2.2洗脫活性和核心質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定將水稻籽實(shí)粉碎后,按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法(GB2906-82)脫去脂肪,風(fēng)干后稱(chēng)取適量,用0.05MTris-HCl(pH7.5)進(jìn)行提取,樣品與提取液之比為1∶10.將提取液樣品置于冰箱內(nèi)10h后,在20000g的高速冷凍離心機(jī)中離心1h,取上清液于冰凍干燥箱內(nèi)濃縮5倍.取濃縮樣品1ml用0.05MTris-HCl溶解,經(jīng)SephadexG75柱進(jìn)行層析分離(2.0×100mm).用0.02MTris-HCl緩沖液(pH7.5)進(jìn)行洗脫.用自動(dòng)部分收集器(BS2-100)以4ml·20min-1的流速,每管4ml收集洗脫液.紫外分光光度計(jì)(BECKMANDU-8B)測(cè)定洗脫液的紫外吸收峰(225nm處),并同步測(cè)定洗脫液中的As濃度.采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)曲線(xiàn)法測(cè)定洗脫液樣品的分子量.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為:牛血清清蛋白(分子量66000)、雞卵清蛋白(分子量45000)、胰蛋白酶(分子量24000)、細(xì)胞色素C(分子量12400),胰島素(分子量5734),均為層析純.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合液與樣品相同的處理方法經(jīng)SephadexG75柱層析,繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).2.3氨基酸測(cè)定按GB7649-87方法,用Biochrom20專(zhuān)業(yè)氨基酸分析儀(瑞典)對(duì)洗脫液樣品中的17種氨基酸含量進(jìn)行分析.2.4制備大米蛋白和凝膠層析分離準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的被研磨的稻米置于燒杯中,加適量的去離子水,在電爐上加熱,煮熟成米飯.然后,按2.2的方法提取蛋白質(zhì)和凝膠層析分離.2.5胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化實(shí)驗(yàn)2.5.1輸注3.3.3m0胃蛋白酶溶液(16mg·L-1):稱(chēng)取胃蛋白酶160mg(Pepsin1∶10000,539units·mg-1,華美生物工程公司),溶于10ml0.02MTris-HCl溶液.胰蛋白酶溶液(30mg·L-1):稱(chēng)取胰蛋白酶300mg(Trypsin1∶250,BE2185,華美生物工程公司),溶于10ml0.02MTris-HCl溶液.2.5.2t保酶凝膠層析人工酶凝膠層析5ml冷凍干燥的水稻蛋白質(zhì)提取液,分別溶于1ml胃蛋白酶溶液和1ml胰蛋白酶溶液,對(duì)照組分別加1ml無(wú)酶的0.02MTris-HCl溶液,37℃恒溫培養(yǎng)5h,然后按2.2的方法凝膠層析過(guò)柱分離.2.6分析方法的確定對(duì)前述各組樣品進(jìn)行消化,方法按文獻(xiàn)進(jìn)行,然后利用氫化物-原子吸收方法測(cè)定樣品中的As(儀器型號(hào):GBC906,HG3000,澳大利亞).為了保證分析方法的準(zhǔn)確性,采用了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)茶葉樣品(GBW07605)進(jìn)行質(zhì)量控制.3結(jié)果與討論3.1洗脫液中as的濃度分布脫脂水稻籽實(shí)樣品經(jīng)Tris-HCl提取后,利用SephadexG75柱進(jìn)行層析分離,分析洗脫液中蛋白質(zhì)紫外吸收峰(OD值)和對(duì)應(yīng)的As濃度分布,結(jié)果見(jiàn)圖1.由圖1可以看出,洗脫液出現(xiàn)3個(gè)明顯的紫外吸收峰,分別出現(xiàn)在洗脫液第15管(1峰)、31管(2峰)和44管(3峰)處.比較3個(gè)紫外吸收峰的OD值大小,第一峰高而窄,第二峰最小,第三峰高而寬,表明水稻籽實(shí)中的蛋白質(zhì)主要集中在第一和第三峰處,經(jīng)與相同條件下的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)曲線(xiàn)對(duì)照,3個(gè)峰的表觀分子量分別為54.5、16.04和5.5KD.從洗脫液中As的濃度分布看,出現(xiàn)了兩個(gè)明顯的As峰,其出現(xiàn)位置恰與第一和第三個(gè)紫外吸收峰相重合,第二紫外吸收處也有少量As分布.由此推斷,水稻籽實(shí)中存在的As主要與表觀分子量為54.5KD和5.5KD的蛋白質(zhì)(或多肽)結(jié)合,形成蛋白質(zhì)-As結(jié)合體.3.2蛋白質(zhì)的氨基酸組成為進(jìn)一步了解蛋白質(zhì)-As結(jié)合體的氨基酸組成,對(duì)經(jīng)凝膠層析分離得到的3個(gè)蛋白質(zhì)(多肽)的17種氨基酸組成進(jìn)行了分析,結(jié)果見(jiàn)表1.由表1可見(jiàn),第Ⅰ和第Ⅲ蛋白質(zhì)組分的氨基酸組成有明顯相似的趨勢(shì),均以Glu、Val、Ile、Leu、Arg、Cys的含量較高.這6種氨基酸之和可占氨基酸總量的63.4%(圖1中1、3組分),兩個(gè)組分中均未檢到Pro,Ser和Thr的含量均較低.第II蛋白質(zhì)組分的氨基酸組成與第Ⅰ和第Ⅲ的主要區(qū)別在于Glu的含量明顯較低.以上結(jié)果表明,水稻籽實(shí)中不同分子量或不同類(lèi)型蛋白質(zhì)的氨基酸組成有一定差異,其與元素As的結(jié)合能力也不同.但是,對(duì)含Se蛋白質(zhì)的類(lèi)型、結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性等仍需進(jìn)一步研究.3.3-也是coa的結(jié)合體的穩(wěn)定性3.3.1紫外吸收法檢測(cè)雙峰紅松林洗脫液中as的濃度變化稻米經(jīng)過(guò)蒸煮變成米飯,加熱的作用會(huì)使稻米里的蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性.圖2為蒸煮后的水稻籽實(shí)Tris-HCl提取液的凝膠層析結(jié)果.與對(duì)照比較(圖1),蒸煮后的洗脫液中原有的3個(gè)蛋白質(zhì)紫外峰的OD值都明顯變小,特別是第一峰下降明顯,在第三峰后原來(lái)沒(méi)有紫外吸收的地方也出現(xiàn)了紫外吸收.同時(shí),洗脫液中As的濃度峰也有明顯的變化,原來(lái)對(duì)照組中出現(xiàn)的兩個(gè)明顯的As濃度峰在蒸煮加熱后不明顯,在1~3峰之間的洗脫液中As的濃度都較低,而在第三峰之后新出現(xiàn)紫外吸收的洗脫液中也出現(xiàn)了As的濃度分布.上述結(jié)果表明,蒸煮加熱能夠使水稻蛋白質(zhì)-As結(jié)合體發(fā)生變化,原因可能是蒸煮加熱使蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性,蛋白質(zhì)凝結(jié),變成不可溶,因此,不能透過(guò)凝膠柱,使峰1和峰2幾乎消失;也有可能破壞了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu),使原有的一些大分子的蛋白質(zhì)-As結(jié)合體發(fā)生改變,或者分解變成蛋白質(zhì)小分子或多肽.因此,與蛋白質(zhì)結(jié)合的As也被釋放出來(lái),或者變成小分子的結(jié)合體形式.3.3.2洗脫液中as的濃度分布圖3為水稻籽實(shí)蛋白質(zhì)經(jīng)胃蛋白酶消化后的凝膠層析結(jié)果.在胃蛋白酶的作用下,洗脫液的蛋白質(zhì)紫外吸收峰發(fā)生了改變,第一個(gè)紫外吸收峰的OD值明顯低于未加酶的對(duì)照組,第二峰比對(duì)照組稍微降低,而第三峰的OD值變化不明顯.洗脫液中As的濃度分布比未加酶的對(duì)照組洗脫液濃度分布有所變化,第一、第三紫外峰處的As濃度降低,而在第三峰之后的洗脫液中沒(méi)有紫外吸收,但可見(jiàn)As的濃度分布.由此可以推斷,新出現(xiàn)的As濃度分布是由第一峰蛋白質(zhì)-As結(jié)合體分解所形成的,可能是一些小分子的肽類(lèi)結(jié)合或游離的As離子.上述結(jié)果也說(shuō)明,胃蛋白酶主要對(duì)分子量為54.5KD的蛋白質(zhì)-As結(jié)合體(第一峰)發(fā)生作用,從第三峰處As的濃度下降,說(shuō)明胃蛋白酶對(duì)分子量為5.5KD的蛋白質(zhì)-As結(jié)合體也有一定的影響.3.3.3胰蛋白酶對(duì)第一峰處的蛋白質(zhì)分子中as的濃度分布及最佳劑量的確定水稻籽實(shí)蛋白質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶消化后的凝膠層析結(jié)果見(jiàn)圖4.在胰蛋白酶作用下,洗脫液的第一紫外吸收峰完全消失,第二峰變化不明顯,第三峰的形狀與對(duì)照組基本一致.由此可見(jiàn),胰蛋白酶能夠徹底分解第一峰處的蛋白質(zhì)分子,即54.5KD的蛋白質(zhì)分子,洗脫液中As的濃度分布也主要出現(xiàn)在第三峰及之后的洗脫液中.與上述胃蛋白酶消化結(jié)果比較,胰蛋白酶對(duì)分子量為54.5KD的蛋白質(zhì)-As結(jié)合體分解得更徹底,而對(duì)5.5KD的蛋白質(zhì)-As結(jié)合體的影響相對(duì)小些,說(shuō)明不同分子量蛋白質(zhì)之間所形成的結(jié)合形態(tài)及其穩(wěn)定性存在一定的差異.3.4不同形態(tài)及銅脅迫對(duì)稻米中as、as、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、maa、dmaa和dmaa的變化已有研究表明,食品中As能以多種形態(tài)存在,常見(jiàn)化合物有亞硒酸鹽(As3+)、硒酸鹽(As5+)、一甲基硒酸(MAA)、二甲基硒酸(DMAA)、三甲基硒酸(TMA)、硒甜菜堿(AB)和硒膽堿(AC)等,各種不同形態(tài)的硒化合物具有不同的毒性,其毒性順序?yàn)锳s(Ⅲ)>As(V)>MAA>DMAA>AB,AC.日本山內(nèi)等也證實(shí)稻米中含有As3+、As5+、MAA和DMAA等形態(tài),其中以As5+為主,其次是DMAA、As3+和MAA.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,不同的As化合物