高效液相色譜法測(cè)定生物質(zhì)乳酸發(fā)酵液中有機(jī)酸及糖類(lèi)

高效液相色譜法測(cè)定生物質(zhì)乳酸發(fā)酵液中有機(jī)酸及糖類(lèi)

硫酸脫硅酸的化學(xué)名稱(chēng)為2-羥基丙酸，復(fù)雜性為chclh（h）cooh。這是一種含有氨基酸和羧基的酸，廣泛存在于人類(lèi)、動(dòng)物、植物和微生物中。它是食品工業(yè)中常用的添加劑和添加劑，也是醫(yī)藥、化工、皮革、香味等行業(yè)的重要原料。在乳酸發(fā)酵過(guò)程中,伴隨產(chǎn)物乳酸生成的同時(shí)還有其他一些有機(jī)酸作為副產(chǎn)物而釋放到環(huán)境中。利用生物質(zhì)水解液發(fā)酵制取乳酸(以下簡(jiǎn)稱(chēng)生物質(zhì)乳酸)是近年來(lái)乳酸生產(chǎn)工藝改進(jìn)的重要方向。測(cè)定生物質(zhì)乳酸發(fā)酵液中糖及各種有機(jī)酸代謝成分組成的變化,對(duì)揭示其代謝途徑以及控制發(fā)酵過(guò)程,進(jìn)而從代謝工程角度改良菌種和優(yōu)化發(fā)酵工藝條件具有重要的意義。目前,傳統(tǒng)發(fā)酵液中的有機(jī)酸多采用酶法或高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定,還原糖采用DNS法(3,5-二硝基水楊酸比色法)測(cè)定。由于采用了多種手段分析發(fā)酵液,分析過(guò)程繁瑣費(fèi)時(shí),故同時(shí)分析發(fā)酵液中的各類(lèi)代謝成分是目前研究的發(fā)展趨勢(shì)。白冬梅等使用反相高效液相色譜方法同時(shí)分析了3種有機(jī)酸和葡萄糖。離子排斥液相色譜法應(yīng)用于生產(chǎn)琥珀酸和富馬酸的發(fā)酵液成分分析已有報(bào)道,但主要集中在純葡萄糖發(fā)酵和常見(jiàn)的代謝產(chǎn)物分析。生物質(zhì)水解液為富含纖維成分的生物質(zhì)原料經(jīng)過(guò)不同的水解過(guò)程獲得的上清液,其一般富含大量的糖分(主要是葡萄糖、木糖和纖維二糖)和少量的酸類(lèi)物質(zhì)(包括甲酸和乙酸)。針對(duì)生物質(zhì)乳酸發(fā)酵工藝建立快速、準(zhǔn)確地同時(shí)測(cè)定多種糖類(lèi)物質(zhì)和有機(jī)酸的分析方法對(duì)于該技術(shù)的發(fā)展具有重要的意義。本研究采用HPLC法,利用Bio-RadAminexHPX-87H糖分析柱,以示差折光檢測(cè)器(RID)檢測(cè),建立了同時(shí)檢測(cè)葡萄糖、木糖、纖維二糖以及包括乳酸在內(nèi)的多種有機(jī)酸等9種組分的方法。該方法可以較準(zhǔn)確地測(cè)定生物質(zhì)乳酸發(fā)酵過(guò)程中的各種糖的消耗量以及乳酸等代謝產(chǎn)物的生成量,這對(duì)于研究微生物菌株的代謝調(diào)控,從而提高乳酸發(fā)酵的產(chǎn)量具有重要的意義。1實(shí)驗(yàn)部分1.1elga:傳統(tǒng)uvf超純水設(shè)備Agilent1200高效液相色譜儀(配示差折光檢測(cè)器,安捷倫化學(xué)工作站);LegendMach1.6R高速冷凍離心機(jī)(Thermo公司);PL303電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);ClassicUVF超純水設(shè)備(美國(guó)ELGA)。L-乳酸(純度為98%;CAS號(hào):79-33-4;美國(guó)Sigma公司);檸檬酸(純度為99.5%;CAS號(hào):5949-29-1)、乙酸(純度為99.5%;CAS號(hào):64-19-7)、草酸(純度為99.5%;CAS號(hào):6153-56-6)(南京化學(xué)試劑有限公司);反丁烯二酸(富馬酸)(純度為99%;CAS號(hào):110-17-8)、琥珀酸(純度為99.0%;CAS號(hào):110-15-6)(國(guó)藥集團(tuán));葡萄糖(純度為99.5%;CAS號(hào):55-99-7)、D(+)-木糖(純度為99.0%;CAS號(hào):58-86-7)(美國(guó)Sigma公司)。1.2柱、溫度和進(jìn)樣量色譜柱:Bio-RadAminexHPX-87H色譜柱(300mm×7.8mm,9μm);流動(dòng)相:5mmol/LH2SO4;流速:0.6mL/min;柱溫:55℃;檢測(cè)器:RID;進(jìn)樣量:10μL;采用外標(biāo)法定量。1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備用去離子水配制9種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的混合溶液,各組分的質(zhì)量濃度見(jiàn)表1。1.4權(quán)利參數(shù)的稀釋取5mL發(fā)酵液,離心(10000r/min,5min)除去菌絲體和碳酸鈣,取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù);取1mL的稀釋液加入0.05mL的72%硫酸進(jìn)行酸解使有機(jī)酸游離出來(lái),離心(10000r/min,3min)除去硫酸鈣,然后用0.22μm的濾膜過(guò)濾即得待測(cè)液。1.5色譜圖對(duì)照在相同的條件下,將樣品色譜圖與有機(jī)酸以及糖類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)液色譜圖對(duì)照,根據(jù)保留時(shí)間確定樣品中各組分的色譜峰;在標(biāo)樣與樣品進(jìn)樣量相同的情況下,應(yīng)用外標(biāo)法定量,計(jì)算樣品中各物質(zhì)的含量。2結(jié)果與討論2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定在1.2節(jié)的色譜條件下測(cè)定各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(其中L-乳酸的色譜圖見(jiàn)圖1a),確定各組分的保留時(shí)間;再測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)液,得到混合標(biāo)準(zhǔn)液的色譜圖(見(jiàn)圖1b)。從圖1b可以看出,各物質(zhì)的出峰順序?yàn)椴菟帷⒗w維二糖、檸檬酸、葡萄糖、木糖、琥珀酸、L-乳酸、富馬酸、乙酸;通過(guò)對(duì)單標(biāo)樣品的色譜圖與混合標(biāo)準(zhǔn)液的色譜圖比照分析,發(fā)現(xiàn)L-乳酸的標(biāo)準(zhǔn)液中含有一定量的琥珀酸。2.2柱溫對(duì)葡萄糖和木糖分離度的影響文獻(xiàn)使用Bio-RadAminexHPX-87H分析柱進(jìn)行有機(jī)酸分析時(shí),選用的柱溫各不相同。為確認(rèn)柱溫對(duì)分析效果的影響,本文考察了柱溫為45~70℃時(shí)的分離情況,結(jié)果如圖2所示。從中可以看出柱溫對(duì)葡萄糖和木糖的分離度影響較大。在60℃以上,木糖的峰出現(xiàn)分裂,在55℃以下此現(xiàn)象消失;通過(guò)對(duì)比單標(biāo)溶液譜圖中的目標(biāo)物峰形,推測(cè)產(chǎn)生這種現(xiàn)象的可能原因是在高溫下木糖的不同構(gòu)型出峰時(shí)間不同。柱溫對(duì)乳酸、富馬酸和乙酸的影響也比較大,在55℃時(shí)這幾種組分的分離效果最好;隨著溫度的升高,富馬酸的保留時(shí)間有所縮短,其他組分的保留時(shí)間基本保持不變,色譜峰形和分離效果隨溫度上升而好轉(zhuǎn)。但在分離中,溫度過(guò)高會(huì)使流動(dòng)相中溶解的氣體揮發(fā)形成氣泡影響色譜分離與檢測(cè)。綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)將柱溫最終設(shè)定為55℃。2.3流速對(duì)分離效果的影響流動(dòng)相的流速對(duì)液相色譜的分離有影響,在一定條件下增加流速會(huì)使分離度減小、峰面積減小、峰寬變窄。通過(guò)不同流速下對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的分離效果來(lái)判斷流速對(duì)分離效果的影響?？疾炝肆魉僭?.4~0.7mL/min范圍內(nèi)的影響。從圖3可以看出,隨著流速的降低各組分的保留時(shí)間都有所增加,且分離度也增加,但效果不明顯。隨著流速的降低,檢測(cè)樣品的時(shí)間也會(huì)相應(yīng)地增加。綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)最終選擇的流速為0.6mL/min。2.4方法的線性回歸用去離子水準(zhǔn)確配制不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別進(jìn)樣10μL測(cè)定,以峰面積A對(duì)質(zhì)量濃度C(g/L)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見(jiàn)表2。以3倍信噪比(S/N)確定檢出限(LOD),各組分的檢出限見(jiàn)表2。2.5米根霉t發(fā)酵液的檢測(cè)利用所建立的方法對(duì)采用汽爆秸稈水解液米根霉搖瓶發(fā)酵72h的發(fā)酵液進(jìn)行定性和定量分析,通過(guò)對(duì)色譜圖(見(jiàn)圖4)的分析,確定發(fā)酵液中主要含有乳酸、富馬酸和葡萄糖。并以米根霉發(fā)酵液稀釋適宜倍數(shù)后作為試驗(yàn)樣本,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)得結(jié)果見(jiàn)表3,葡萄糖、乳酸、富馬酸和乙酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.81%、0.96%、4.04%和4.61%。同時(shí)以稀釋一定倍數(shù)的米根霉發(fā)酵液作為試驗(yàn)樣品,平行取樣6次進(jìn)行2個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表4,得到各種酸及糖類(lèi)化合物的加標(biāo)回收率在96.91%~103.11%之間。3定量分析方法采用Bio-RadAminexHPX-87H色譜柱建立了同時(shí)測(cè)定生物質(zhì)發(fā)酵液中多種有機(jī)酸和糖類(lèi)化合物的定性和定量分析方法。該方法準(zhǔn)確可靠,可實(shí)現(xiàn)對(duì)生