生物工程-氨基酸取代對螺旋型抗菌肽活性的影響

目錄TOC\o"1-3"\u第一章前言 第一章前言自然存在著多種病原微生物，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康和生存，而抵抗病原微生物的常用方法是使用抗生素類藥物。在上世紀(jì)40年代，世界上第一種抗生素首次被科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，后被投入醫(yī)藥界，用于醫(yī)治疾病和改善人們的健康水平，至今已經(jīng)有將近80多年的歷史了?？股氐膯柺溃瑯O大地改善了人們的生活質(zhì)量和健康水平。但“自古成敗皆一人”，由于全球人類在生活生產(chǎn)各方面對抗生素的濫用，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，而且很難有效將其消滅，不斷涌現(xiàn)出各種耐藥菌比如耐藥性腸桿菌、結(jié)核桿菌和超級耐藥菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）等，這些不斷涌現(xiàn)且很難消滅的耐藥菌使得細(xì)菌感染性疾病再次成為困擾人們的難題。據(jù)《柳葉刀》雜志報道，近期在英美印度等國家小規(guī)模爆發(fā)的細(xì)菌感染性疾病由一種新型的耐藥性超級細(xì)菌NDM—1引發(fā)，現(xiàn)今存在的抗生素對其無效?，F(xiàn)在有越來越多的細(xì)菌、病毒出現(xiàn)了對藥品和抗生素的抗藥性，導(dǎo)致這些舊時的醫(yī)藥和抗生素對這些細(xì)菌和病毒已經(jīng)不能起到很好的殺滅和抑制作用。在加上對這些細(xì)菌和病毒來講，殺滅和抑制作用很強(qiáng)的藥品、抗生素的開發(fā)和研制進(jìn)程緩慢，因此尋求一種對病毒和細(xì)菌殺滅抑制作用強(qiáng)并且高效廣譜、無殘留、無耐藥性、低副作用的抗生素替代品，成為近年來人們一直努力的目標(biāo)。1.1抗菌肽綜述抗菌肽是一類來自于生物本身免疫系統(tǒng)的防御分子，具有抵御外源分子侵害、特異性識別清除體內(nèi)病變細(xì)胞的功能。上世紀(jì)70年代，Bakula和Hink等科學(xué)家通過精心研究發(fā)現(xiàn)了能對細(xì)菌起到很好的殺滅和抑制作用的物質(zhì)，他們首次從大蠟螟(Galleriamellonella)和黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)的血淋巴細(xì)跑中提取到了這種物質(zhì)。之后于1974年，瑞典科學(xué)家Boman等通過向眉紋天蠶蛾蛹注入大腸埃希菌，然后在血淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種具有抗菌活性的堿類多肽物質(zhì)，而且極低濃度的提取物在5分鐘之內(nèi)即能殺死103—104數(shù)量級的E.coli。隨后在古比天蠶蛹中也發(fā)現(xiàn)了類似的抗菌活性物質(zhì)，1981年，這種具有抗菌活性的物質(zhì)被正式命名為cecropin（抗菌肽）?？咕膹V泛分布在包括哺乳動物，植物，鳥類，兩棲動物，魚類，昆蟲和微生物在內(nèi)的幾乎所有物種。抗菌肽是非常有效的，并在天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括細(xì)菌，病毒，寄生蟲，真菌甚至癌細(xì)胞等病原體。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)超過2400個抗菌肽，并且166個肽已經(jīng)表現(xiàn)出抗癌活性。相比于傳統(tǒng)抗生素，抗生素?fù)碛惺軣岵灰追纸?、廣譜性、在水中有較好的溶解度、對細(xì)菌和病毒的殺滅和抑制作用強(qiáng)等優(yōu)點，可以說是一種擁有很大的研究和實際價值的物質(zhì)。抗菌肽的構(gòu)造分為一級構(gòu)造和二級構(gòu)造，二者結(jié)構(gòu)差異很大。一級構(gòu)造從某種程度上來說具有一定的保守性，在它的N端和C端分別含有對誰比較親和的Arg和Lys氨基酸殘基，它們PH呈堿性。而相比一級結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)呈圓環(huán)形，有的還延伸堆疊成一定的片狀結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)在空間在具有一定的規(guī)律性，大多呈現(xiàn)出α-螺旋結(jié)構(gòu)，β-折疊，這兩種結(jié)構(gòu)對水脂都是比較親和的。抗菌肽通常表現(xiàn)出以下性質(zhì)：①富含堿性氨基酸，例如賴氨酸和精氨酸，這使得多肽在中性pH中表現(xiàn)出+2至+9的凈正電荷；②它們通常由5-40個氨基酸殘基組成，疏水殘基的百分比大于30％；③通常具有兩親性，在疏水環(huán)境中同時具有極性和非極性表面的構(gòu)象。1.2抗菌肽作用機(jī)理與陽離子抗菌肽相比之前研制和發(fā)現(xiàn)的抗生素藥物在體內(nèi)作用于某些固定的靶蛋白，具有一定的定向性。而陽離子抗菌肽在體內(nèi)的作用機(jī)理確完全不同，它直接做用于細(xì)胞膜，它通過接觸、吸附、粘結(jié)在細(xì)胞上，并釋放某些可以使細(xì)胞膜發(fā)生裂解的物質(zhì)，最后導(dǎo)師細(xì)胞細(xì)胞膜破裂，而失去活力。雖然抗菌肽的具體作用機(jī)制還不太清楚，但是目前來說，在生物界和學(xué)術(shù)界普遍被認(rèn)同的學(xué)說有如下四種假說：去垢劑的細(xì)胞膜溶解模式、桶板模式、地毯模式和蟲孔模式。①地毯模式：在這個假說中?？咕木拖褚粔K毛毯，均勻排列在細(xì)胞膜上，將細(xì)胞緊緊遮蓋，抗菌肽與構(gòu)成細(xì)胞膜的磷脂雙分子中的頭部相互接觸，當(dāng)與細(xì)胞膜接觸的抗菌肽足夠多時，細(xì)胞膜收壓會逐漸彎曲失穩(wěn)，這樣就破壞了細(xì)胞膜的原生結(jié)構(gòu)，會使細(xì)胞膜惡化，導(dǎo)致細(xì)胞失去活性，細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)質(zhì)就會流出。②桶板模式：抗菌肽利用靜電吸引作用結(jié)合于細(xì)菌細(xì)胞膜表面并發(fā)生聚合，這樣會導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生改變，并且抗菌肽會以多聚體的形式從垂直細(xì)胞膜的方向貫穿到構(gòu)成細(xì)胞膜的磷脂雙分子中。多肽分子疏水面朝通道外部，親水面朝通道內(nèi)部，從而形成橫跨細(xì)胞膜的離子通道。③蟲孔模式：抗菌肽平鋪在細(xì)胞膜上，抗菌肽的親水基會與細(xì)胞膜中的親水部分接觸，即與細(xì)胞膜的磷脂雙分子接觸，而疏水基會進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)，與細(xì)胞膜內(nèi)的疏水部分接觸，當(dāng)細(xì)胞膜所接觸的抗菌肽逐漸增多時，細(xì)胞膜的心態(tài)就會發(fā)生改變，細(xì)胞膜會在抗菌肽的作用下形態(tài)拉伸變長，當(dāng)細(xì)胞膜的心態(tài)繼續(xù)變長時，就會形成蟲孔式通道。④去垢劑模式：顧名思義，多肽起到了除垢劑的作用，當(dāng)細(xì)胞膜與逐漸多的多肽接觸時，多肽的親水基和疏水基就會將磷脂雙分子破壞，使其變成一段一段的膠態(tài)離子，這樣就會破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使得細(xì)胞變性失活，最后使得宿主結(jié)構(gòu)找到破壞。1.3本文的研究目的和策略如前所述，許多抗菌肽都具有富含正電性的精氨酸和賴氨酸，而許多穿膜肽則富含精氨酸，為了對比研究精氨酸和賴氨酸對抗菌肽的抗菌活性、溶血毒性以及與細(xì)菌內(nèi)膜和外膜的相互作用能力的影響，在本研究中，我們以前期工作的抗菌肽HPRP-A1為模板，通過利用精氨酸取代原始的賴氨酸，設(shè)計合成了三條含有不同精氨酸數(shù)量的抗菌肽，并對其活性進(jìn)行研究分析。

第二章抗菌肽的設(shè)計、合成以及活性表征第一節(jié)實驗試劑與儀器1.1實驗試劑及來源HBTU吉爾生化有限公司（上海）N,N—二甲基甲酰胺吉爾生化有限公司（上海）HOBT吉爾生化有限公司（上海）異丙醇北京化工廠二氯甲烷北京化工廠二甲苯北京化工廠甲醇北京化工廠無水乙醇北京化工廠苯酚中國惠世生化試劑有限公司（上海）水合茚三酮中國惠世生化試劑有限公司（上海）六氫吡啶（哌啶）鄭州萬博化工產(chǎn)品有限公司乙酸酐鄭州萬博化工產(chǎn)品有限公司RinkamideMBHA樹脂天津南開合成科技有限公司NPN（1-N-phenyl-naphtylamine）Sigma-Aldrich公司，棕色瓶4℃儲存鄰硝基苯β-D-半乳糖苷中國科學(xué)院上海生化所溶液A：5g水合茚三酮，100ml乙醇溶液B：80g熔融苯酚，20ml乙醇剪切液：哌啶:DMF=1:4（體積比）1.2實驗儀器設(shè)備通風(fēng)櫥SONLAB大連誠譽(yù)實驗設(shè)備有限公司氣浴恒溫振蕩器THZ—92B上海博遠(yuǎn)實業(yè)有限公司循環(huán)水式多用真空泵SHB—ⅢA上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司電子天平HZK—210溫州華智科學(xué)儀器有限公司恒溫培養(yǎng)器GL—150北京維欣儀奧科技發(fā)展有限公司冷凍干燥機(jī)FD—1D—50北京博醫(yī)康公司分析型高效液相色譜LC—20A日本島津公司制備型高效液相色譜LC—6A日本島津公司CO2培養(yǎng)箱MCO—15AC日本三洋公司紫外分光光度計UV-2550日本島津公司熒光分光光度計RF-5301PC日本島津公司

第二節(jié)多肽合成、純化與表征2.1多肽合成本實驗采用多肽合成的方法是固相合成，原理是首先將固相樹脂載體上的化學(xué)基團(tuán)和氨基酸的羧基末端連接，通過固體樹脂載體上的化學(xué)基團(tuán)與氨基酸的羧基末端相連接，暴露氨基端連接肽，接著利用一定的方法處理需要連接的氨基酸，保護(hù)其氨基端和側(cè)鏈基團(tuán)，暴露與活化其羧基端，進(jìn)而同固相樹脂的氨基端進(jìn)行連接反應(yīng)。通過使肽鏈氨基端脫保護(hù)，連接一個氨基酸，再使氨基端脫保護(hù)，再連接下一個氨基酸，通過重復(fù)以上過程，就可以得到所需要的肽鏈。具體實驗方法：A.樹脂的浸泡活化稱取250mg(0.2mmol)RinkamideMBHAresin加入合成管中，浸泡在3ml的DCM溶液中B.樹脂F(xiàn)MOC保護(hù)基脫保護(hù)1.采用真空泵減壓設(shè)施抽濾除掉DCM2.加入事先提取的8ml含哌啶20%的DMF剪切溶液3.25℃恒溫振蕩器中放置30分鐘，之后利用真空泵減壓設(shè)施抽濾除掉剪切溶液4.用3mlDCM、異丙醇、DMF逐次清洗兩遍C.氨基酸連接1.氨基酸的活化：于1.6（1.2）ml0.45MHBTU,1.6(1.2)ml0.35MHOBT,220（165）ulDIEA(0.742g/ml)中分別加入事先裝備的0.8(0.6)mmolL-Fmoc-AA，充分混合，使其均勻。之后進(jìn)行活化。（括號內(nèi)為配置的1：3的氨基酸）2.提取活化的氨基酸于合成管中，再加入3mlH氨基酸，1.5ml二甲苯，6mlDCM，其作用是為使得樹脂懸浮。25度氣浴恒溫振蕩器搖3-5h（H氨基酸反應(yīng)6h.）。多肽連接到十個氨基酸后可以過夜反應(yīng)，不需要過夜的反應(yīng)樹脂用5mlDMF浸泡保護(hù)。3.真空泵減壓抽濾除去反應(yīng)溶液4.依次用約3mlDMF、異丙醇、DCM洗兩遍D．茚三酮法檢測取微量樹脂于1.5mlEP管中，之后依次加入50ulA,B，使其混合均均后，在100C的恒溫培養(yǎng)器中放置5分鐘，觀察培養(yǎng)基中液體的額顏色。弱顏色為明亮的大黃顏色，則證明反應(yīng)結(jié)束了，如果是其他顏色，則證明反應(yīng)沒有徹底完成，需要重復(fù)上面的步驟來使其進(jìn)行反應(yīng)徹底。E.氨基酸FMOC保護(hù)基脫保護(hù)1.按照DMF：哌啶=4：1的比例提取8ml含哌啶20%的DMF剪切溶液2.在25℃恒溫振蕩器中放置30分鐘，之后利用真空泵減壓設(shè)施抽濾除掉剪切溶液3.用濃度3ml的DCM、異丙醇、DMF依次清洗兩遍F.茚三酮法檢測取微量樹脂于1.5mlEP管中，之后依次加入50ulA,B液，使其混合均均后，在100C的恒溫培養(yǎng)器中放置5分鐘，觀察培養(yǎng)基中液體的額顏色。弱顏色為紫藍(lán)色，就證明了氨基酸脫保護(hù)成功。（若脫保護(hù)未成功，則需要重復(fù)E-F步驟，直到成功。）G．按照C到F過程，繼續(xù)連接下一個氨基酸。H．乙?；?.按照DMF：哌啶=4：1的比例提取8ml含哌啶20%的DMF剪切溶液。帶無哦呦氨基酸已全部連接，25℃恒溫振蕩器中放置30分鐘，之后利用真空泵減壓設(shè)施抽濾除掉剪切溶液2.用3mlDCM、異丙醇、DMF逐次清洗兩遍3.加入1.0ml（1000ul）DCM和4mlDMF4.按照每0.2mmol樹脂加500ul(AcO)2O和800ulDIEA的標(biāo)準(zhǔn)，逐次加入(AcO)2O和DIEA，之后再25℃恒溫振蕩器中放置30分鐘5.濃度為3ml的DCM沖洗三遍，每次沖洗時長為2min，之后重復(fù)D過程（茚三酮檢測）6.待檢測結(jié)束后，用3mlDCM、DMF、DCM,MeOH,DCM逐次清洗7.真空泵減壓設(shè)施抽濾除掉剪切溶液I.多肽剪切1.向多肽合成管中加入TFA（90％）、TIS（5％）、水（5％），混合均勻，室溫條件下放入氣浴恒溫振蕩器震蕩2小時2.無水乙醚放入-20℃冰箱預(yù)冷，將剪切液滴入預(yù)冷的無水乙醚中3.再次向多肽合成管中加入5％TIS和水、90％TFA，充分混合使其均勻，然后放置在25℃的恒溫振蕩器中放置1h。4.將剪切液滴入預(yù)冷的無水乙醚中，使其逐漸沉淀，分層，待分層后利用真空泵除去上清液。5.將沉淀溶解在50％的乙腈水溶液中，在低溫浴槽結(jié)凍成冰狀6.在凍干機(jī)內(nèi)的真空環(huán)境干燥多肽，將提取的粗制的多肽密封保存在零下20攝氏度的環(huán)境中。2.2多肽純化合成完畢的粗肽經(jīng)過反相高效液相色譜進(jìn)行提純。在分離提純前，我們需要將粗制的多肽略取少許制成濃度為1mg/ml的溶液，用RP-HPLC進(jìn)行分析色譜分析，通過監(jiān)測其在色譜中保留時間的長短，據(jù)此設(shè)置不同的梯度來進(jìn)行洗脫。之后配置溶液A是含0.1％三氟乙酸的水，溶液B是含0.1％三氟乙酸的乙腈，A、B兩種溶液是用來洗脫的，在用之前必須用0.22μm的濾膜過濾而且再進(jìn)行超聲脫氣才可使用。接下來，我們用純凈水將凍干的多肽充分溶解，之后在10000rpm中離心5min，把上清液通過0.22μm的濾膜就行過濾。將過濾后的上清液在Zorbax300SB-C8柱子(實際大小6.5μm，孔徑為300?，AgilentTechnologies，規(guī)格為250×9.4mmI.D.)進(jìn)行實驗，程序是之前設(shè)定好的，流速為2毫升/分鐘。經(jīng)過以上的分離提純步驟，我們能得到純度至少95％以上的多肽。純化后得到的多肽樣品經(jīng)電噴霧質(zhì)譜和氨基酸組成分析進(jìn)行定量確認(rèn)后，進(jìn)行生物活性測定。2.3多肽表征本實驗需要合成的抗菌肽：HPRP-A1Ac-FKKLKKLFSKLWNWK-amideHPRP-A1-2RAc-FRKLKKLFSKLWNWR-amideHPRP-A1-4RAc-FRKLKRLFSRLWNWR-amideHPRP-A1-6RAc-FRRLRRLFSRLWNWR-amide圖1：HPRP-A1-2R質(zhì)譜圖圖2：HPRP-A1-2R色譜圖圖3：HPRP-A1-4R質(zhì)譜圖圖4：HPRP-A1-4R色譜圖圖5：HPRP-A1-6R質(zhì)譜圖圖6：HPRP-A1-6R色譜圖圖7：HPRP-A1色譜圖HPRP-A1-2R、HPRP-A1-4R、HPRP-A1-6R分別是二、四、六個精氨酸取代原始肽鏈中賴氨酸合成得到的多肽，圖1--圖6是其質(zhì)譜圖和色譜圖，將以上結(jié)果總結(jié)得到以下表格。理論分子量/g.mol-1實際分子量/g.mol-1保留時間/min純度/℃HPRP-A11697HPRP-A1-2R20912091.041796HPRP-A1-4R21472146.7217.596HPRP-A1-6R22032202.9118.596

第三節(jié)MICMHC法檢測抗菌肽活性表征實驗中共利用了四種細(xì)菌，兩種革蘭氏陽性菌，金黃色葡萄球菌（S.aereus）和枯草芽孢桿菌(B.aubtilis)；兩種革蘭氏陰性菌，綠膿桿菌(P.aerugino)和大腸桿菌(E.coli)。使用了四種抗菌肽，HPRP-A1、HPRP-A1-2R、HPRP-A1-4R、HPRP-A1-6R。3.1抗菌活性測定a.細(xì)菌復(fù)蘇：利用滅菌的接種環(huán)蘸取菌液在LB固體培養(yǎng)基劃線，37℃，過夜培養(yǎng)b.細(xì)菌培養(yǎng)：挑取單克隆菌種接種至LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)16hc.樣品稀釋：將準(zhǔn)備好的多肽溶解在PBS中，按照2倍梯度加水稀釋，共稀釋成8個濃度梯度。d.加樣：將稀釋后的多肽加入96孔板中，每孔10μl。e.菌液稀釋：將菌液稀釋成濃度5×105個/ml，用排槍加入到U型96孔板中，每孔90μl。f.37℃震蕩24小時，靜置10min，肉眼觀察，澄清孔者為多肽抑制了細(xì)菌的生長，臨界于渾濁孔的澄清孔為多肽的最低抑菌濃度。3.2溶血活性測定a.樣品稀釋：將準(zhǔn)備好的多肽溶解在PBS中，按照2倍梯度加水稀釋，共稀釋成8個濃度梯度。b.加樣：將稀釋后的多肽加入96孔板中（96孔板需事先加入紅細(xì)胞），每孔10μlc.用EDTA抗凝管抽取2~3毫升人血，要混合均勻，之后置于4℃的環(huán)境中保存。d.在提取的2ml血液中加入事先配置好的PBS緩沖液2-3ml，之后再1000rpm中離心5分鐘。重復(fù)上步驟兩次，之后配置新的PBS，此時加入PBS緩沖液的量為40ml，此時血細(xì)胞濃度為2×108個/ml。e.按照以下設(shè)定加U型96孔板實驗組：紅細(xì)胞懸液以70μl+多肽溶液70μl/孔空白對照：140μlPBS/孔；陰性組：（70μl紅細(xì)胞懸液+70μlPBS）/孔；陽性組：取2ml紅細(xì)胞懸液，離心，棄去PBS，加入2ml純水，細(xì)胞破裂混勻，70μl紅細(xì)胞裂解液+70μl水/孔f.在37攝氏度下，87rpm的環(huán)境中孵育振蕩2小時，之后3000rpm離心5min。吸取90μl上清液體至平底96孔板中，監(jiān)測578nm處吸光值。g.滿足（OD實驗-OD陰性）/(陽性-陰性)大于0.1條件的第一個濃度為MHC。3.3結(jié)果分析peptideMIC(μM)MHC(μM)P.aeruginoB.aubtilisE.coliS.aereusHPRP-A116881664HPRP-A1-2R32483264HPRP-A1-4R644161632HPRP-A1-6R6483232323.3.1MIC實驗結(jié)果分析綠膿桿菌(P.aerugino)，由表格數(shù)據(jù)可以看出，四種抗菌肽對其的MIC數(shù)值都比較大，表明四種抗菌肽對綠膿桿菌的殺傷能力比較差。經(jīng)查閱文獻(xiàn)可得，綠膿桿菌屬于革蘭氏陰性菌，有莢膜，對于化學(xué)藥物的抵抗力比一般革蘭氏陰性菌強(qiáng)大，青霉素對其無效，所以四種抗菌肽對其抑菌能力不強(qiáng)是可以理解的。而經(jīng)眾多研究表明，綠膿桿菌的耐藥機(jī)理有四種：①產(chǎn)生抗生素滅活酶或抗生素修飾酶；②抑制降低了藥物穿透細(xì)胞壁的滲透力，從而減少了到達(dá)作用靶點藥物的濃度；③改變抗菌藥物作用靶點的位置，從而逃避抗菌作用；④細(xì)菌本身的膜屏障與主動外排作用，從而限制藥物到達(dá)作用靶位。枯草芽孢桿菌(B.aubtilis)，根據(jù)表格數(shù)據(jù)可知四種抗菌肽對其的滅殺能力相當(dāng)強(qiáng)，可以在很低濃度下造成很大的殺傷力。經(jīng)文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，無莢膜，這可能是枯草芽孢桿菌對抗菌肽抗性很低的原因。從數(shù)據(jù)整體來看，母肽HPRP-A1對四種菌的殺傷能力都位列前排，說明母肽的抗菌活性是最強(qiáng)的。而對于改造后的抗菌肽可能針對某些菌株殺傷能力較強(qiáng)，例如抗菌肽HPRP-A1-2R針對枯草芽孢桿菌(B.aubtilis)，抗菌肽HPRP-A1-4R針對枯草芽孢桿菌(B.aubtilis)與金黃色葡萄球菌（S.aereus），但是抗菌肽HPRP-A1-6R對四種菌株的殺傷性都不是很強(qiáng)。3.3.2MHC結(jié)果分析MHC表示多肽對正常紅細(xì)胞的毒性，數(shù)值越大，毒性越小，所以根據(jù)數(shù)值來看，抗菌肽HPRP-A1、HPRP-A1-2R相對HPRP-A1-4R、HPRP-A1-6R毒性低。3.3.3綜合分析根據(jù)MIC、MHC兩項實驗的結(jié)果綜合分析討論，母肽HPRP-A1具有優(yōu)良的抗菌活性，對于各類細(xì)菌均具有強(qiáng)大的滅殺能力，并且對正常紅細(xì)胞的毒性小。但是隨著多肽鏈中賴氨酸被精氨酸逐漸取代，抗菌肽對各類細(xì)菌的殺傷力變得降低，而且對正常紅細(xì)胞的毒性升高，所以賴氨酸相對于精氨酸具有更好的抗菌活性和更低的細(xì)胞毒性。

第三章抗菌肽穿膜能力研究第一節(jié)ONPG內(nèi)膜穿透實驗1.1原理當(dāng)細(xì)菌在有乳糖存在的環(huán)境中就會從自身細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生一種可使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖的水解酶——β-半乳糖苷酶。一種乳糖的類似物ONPG（鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷）目前已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)能很快地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。根據(jù)β-半乳糖苷酶將ONPG分解成黃色的鄰-硝基苯酚和半乳糖，因此可從培養(yǎng)液的顏色來判斷是否有β-半乳糖苷酶存在。對大腸桿菌細(xì)胞來講，鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷進(jìn)去他的細(xì)胞還需要乳糖透性酶的幫助，因此這段時間內(nèi)β-半乳糖苷酶的活性就會降低。當(dāng)細(xì)胞膜的機(jī)構(gòu)找到破壞時，細(xì)胞的通透性就會降低，此時ONPG能快速進(jìn)去細(xì)胞內(nèi)，OD值快速升高。因此?？赏ㄟ^監(jiān)測β-半乳糖苷酶活性來判斷抗菌肽對細(xì)胞通透造成的影響。1.2過程實驗菌種：大腸桿菌E.coliML-35ATCC43827培養(yǎng)基：含5％乳糖的LB液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，乳糖50g,加入雙蒸水950ml，調(diào)節(jié)pH達(dá)到7.4后用雙蒸水定容至1000ml）細(xì)菌處理：利用含有5%乳糖的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，收集細(xì)菌，用無菌水重懸，使其OD420nm=1.2。將1000μl細(xì)菌懸液與100μl30mM鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷(o-Nitrophenyl-β-D-galactoside，ONPG)混合，然后加入16μg/ml的抗菌肽HPRP-A1、HPRP-A1-2R、HPRP-A1-4R、HPRP-A1-6R900μl,陰性對照組加入0.5%NaCl，使用紫外分光光度計連續(xù)檢測90min（設(shè)定波長為OD420nm）。1.3結(jié)果根據(jù)圖可以看出，抗菌肽HPRP-A1所達(dá)到的最高值明顯高于其他抗菌肽和陰性，由此可以得到抗菌肽HPRP-A1對大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)膜的穿透性很徹底，使得OD420nm值達(dá)到最高。然后再來看每條圖線的斜率，抗菌肽HPRP-A1的圖線斜率最大，達(dá)到頂峰所用的時間最短，這表明抗菌肽HPRP-A1對大腸桿菌細(xì)胞的破環(huán)最迅速，其對大腸桿菌的殺滅能力最強(qiáng)。從圖的整體看，根據(jù)折線最高點和斜率對四個抗菌肽的滅菌能力進(jìn)行排序：HPRP-A1>HPRP-A1-2R>HPRP-A1-4R>HPRP-A1-6R。

第二節(jié)NPN外膜穿透實驗2.1原理NPN是一種疏水性熒光探針，當(dāng)處在親水環(huán)境中它的熒光效果就會減弱。當(dāng)革蘭氏陰性菌整體完整時，外膜的疏水分子不會暴露出來，然而一旦外膜被穿透，磷脂暴露，疏水熒光探針NPN就與外膜磷脂層結(jié)合發(fā)出熒光，因此可用熒光分光光度計發(fā)出的熒光強(qiáng)度來判斷細(xì)胞膜是否破壞以及破壞程度。2.2過程實驗菌種：大腸桿菌E.coliML-35ATCC43827培養(yǎng)基：LB除鹽培養(yǎng)基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，加入雙蒸水950ml，調(diào)節(jié)pH達(dá)到7.4后用雙蒸水定容至1000ml）細(xì)菌處理：將大腸桿菌接種于20ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)18小時；然后取1ml菌液接種到50ml的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)至OD600nm=0.4~0.6。4000g(RCF)×10分鐘離心后收集菌體，利用Buffer（pH7.4,4.5mMHEPES,5mMNaN3）重懸至OD600nm=0.5。取300μl抗菌肽HPRP-A1、HPRP-A1-2R、HPRP-A1-4R、HPRP-A1-6R溶液加入到2.7ml菌液中，陰性對照組加入相同體積Buffer（pH7.4,4.5mMHEPES,5mMNaN3），抗菌肽的濃度設(shè)立三個對照組，分別200μm/ml、400μm/ml、800μm/ml。設(shè)定激發(fā)波長為使用熒光分光光度計連續(xù)檢測10min，激發(fā)波長設(shè)定為OD350nm，發(fā)射波長為OD420nm。2.3結(jié)果圖是200μm/ml抗菌肽NPN外膜穿透實驗利用熒光分光光度計檢測進(jìn)行數(shù)據(jù)處理后得到的結(jié)果。根據(jù)圖像中不同顏色圖線的最高點進(jìn)行分析，得到結(jié)論：母肽HPRP-A1和改造后的抗菌肽HPRP-A1-2R同時達(dá)到相同高度，表示在200μm/ml抗菌肽濃度之下，母肽HPRP-A1和改造后的抗菌肽HPRP-A1-2R對大腸桿菌的外膜穿透能力相差不大，而其他抗菌肽HPRP-A1-4R、HPRP-A1-6R對大腸桿菌的外膜殺傷能力略差。而且母肽HPRP-A1和改造后的抗菌肽HPRP-A1-2R在0.5分鐘就達(dá)到最高值，表明殺傷大腸桿菌的速度快，效率高。針對200μm/ml抗菌肽為NPN外膜穿透能力進(jìn)行排序：HPRP-A1=HPRP-A1-2R>HPRP-A1-4R>HPRP-A1-6R。圖為400μm/ml抗菌肽NPN外膜穿透實驗利用熒光分光光度計檢測進(jìn)行數(shù)據(jù)處理后得