米曲霉產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基優(yōu)化研究

米曲霉產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基優(yōu)化研究

美曲霉具有豐富的酶系統(tǒng)，可產(chǎn)生酸性、中性和堿性酶。它穩(wěn)定性高，能在高耐候性條件下工作。廣泛應(yīng)用于食品、藥物和食品等行業(yè)。米曲霉也是美國(guó)食品與藥物管理局和美國(guó)飼料公司協(xié)會(huì)1989年公布的40余種安全微生物菌種之一。國(guó)內(nèi)外已有關(guān)于米曲霉蛋白酶特性及米曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶適宜條件的研究報(bào)道,但米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的適宜條件方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。為建立利用米曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶的技術(shù),筆者通過(guò)對(duì)菌株的初篩及培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件的研究,提高了米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的能力。1材料和方法1.1材料表面1.1.1病毒米曲霉(Aspergillusoyrzae)來(lái)自于廣東省微生物研究所。1.1.2基礎(chǔ)培訓(xùn)1.1.2.酵母膏和khpo葡萄糖2g,蛋白胨1g,牛肉膏1g,酵母膏0.15g,MgSO40.1g,K2HPO40.2g,蒸餾水100mL,瓊脂1.5g,pH6.5～7.0。1.1.2.2.固體發(fā)酵培養(yǎng)基m豆皮m(豆粕粉)∶m(水)=3∶2∶5,pH6.0～7.0(自然pH)。1.2主要原材料和設(shè)備1.2.1特效藥除酪蛋白為生化試劑,Folin-酚試劑自己配制外,其他藥品均為分析純?cè)噭?。麥麩、豆粕為市?gòu)。1.2.2儀器752紫外光柵分光光度計(jì)、數(shù)顯恒溫水浴鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、手提式高壓滅菌鍋、ORION710型精密pH計(jì)等。1.3方法1.3.1粗酶液的提取準(zhǔn)確稱(chēng)取1g攪勻的培養(yǎng)物于研缽中,加入一定量的pH3.0或pH7.2或pH10.0的緩沖液,研勻,置30℃恒溫培養(yǎng)箱中抽提30min,每10min攪動(dòng)一次,最后用4層紗布過(guò)濾,濾液即為粗酶液,適當(dāng)稀釋后用于酶活力測(cè)定(pH3.0緩沖液為乳酸-乳酸鈉緩沖液,pH7.2緩沖液為磷酸緩沖液,pH10.0緩沖液為硼砂-氫氧化鈉緩沖液)。1.3.2酪氨酸活力單位采用Folin酚法。40℃下,每1min水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸定義為1個(gè)蛋白酶活力單位U,酶活力單位由公式u=kAn4/10計(jì)算。式中,u,酶活力單位;A,吸光度;k,吸光度為1.000時(shí)對(duì)應(yīng)的酪氨酸質(zhì)量濃度;n,總稀釋倍數(shù);反應(yīng)體積為4mL,反應(yīng)時(shí)間為10min。2結(jié)果與討論2.1線性范圍在λ=680nm時(shí),酪氨酸濃度在0～100mg·L-1范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。其回歸方程為A=0.0119C+0.023(n=8),r2=0.999,k=82.1。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。2.2最產(chǎn)酶活力測(cè)定米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶,其中主要產(chǎn)生中性和堿性兩種蛋白酶。在培養(yǎng)24h時(shí)各種蛋白酶酶活力仍然很低,然后隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,而逐漸增加到一個(gè)峰值后,就開(kāi)始逐漸降低(圖2)。峰值即表示在該條件下,達(dá)到最高產(chǎn)酶量所需的時(shí)間和最大酶活力。產(chǎn)酸性蛋白酶的最適時(shí)間為48h,產(chǎn)中性蛋白酶的最適時(shí)間為60h,產(chǎn)堿性蛋白酶的最適時(shí)間為54h。2.3不同生長(zhǎng)溫度對(duì)米曲霉產(chǎn)酶的影響不同溫度條件下培養(yǎng)的米曲霉,其酶活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明,在接種量和培養(yǎng)條件完全一致的情況下,培養(yǎng)溫度為30℃時(shí),酶活力最高。因此,認(rèn)為30℃為該米曲霉的最適培養(yǎng)溫度。在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),20、25、40、45℃的培養(yǎng)基上見(jiàn)白色菌絲,25、40℃培養(yǎng)的培養(yǎng)基上偶見(jiàn)綠色孢子,而30、35℃培養(yǎng)的培養(yǎng)基上則布滿了綠色孢子。因此,可以判定20、25、40、45℃時(shí)由于生長(zhǎng)溫度不適,米曲霉生長(zhǎng)不好,造成產(chǎn)酶較少,酶活力較低;35℃時(shí),米曲霉雖然生長(zhǎng)較好,但不利于米曲霉產(chǎn)酶,另外溫度較高,酶的穩(wěn)定性也下降,造成酶活力較低。方差分析結(jié)果也表明培養(yǎng)溫度對(duì)米曲霉產(chǎn)酶能力有顯著的影響(P<0.05),多重比較結(jié)果顯示,20℃和35℃間差異不顯著(P>0.05),其余各組間差異顯著(P<0.05)。2.4培養(yǎng)基起始ph值對(duì)酶活力的影響不同起始pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的米曲霉(用NaOH或HCl調(diào)節(jié))的酶活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明:培養(yǎng)基起始pH值適宜范圍為6～7,在pH為6.0時(shí)酶活力最高。方差分析結(jié)果表明培養(yǎng)基起始pH值對(duì)米曲霉產(chǎn)酶能力有顯著的影響(P<0.05),多重比較結(jié)果顯示,pH為5.0、8.0和9.0組間差異不顯著(P>0.05),其余各組間差異顯著(P<0.05)。2.5培養(yǎng)基總酶活力測(cè)定用水分含量不同的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)米曲霉,酶活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可看出,在加水量為5.0mL,即培養(yǎng)基的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50.0%時(shí),其單位酶活力最高,達(dá)1489.2U·g-1。在加水量為7.5mL,即培養(yǎng)基的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60.0%時(shí),其總酶活力最高,達(dá)17681U。因此,認(rèn)為培養(yǎng)基最適的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50.0%～66.7%。方差分析結(jié)果表明,水分對(duì)米曲霉培養(yǎng)物的單位酶活力有顯著的影響(P<0.05),多重比較結(jié)果顯示,加水量為5.0mL和7.5mL組間差異不顯著(P>0.05),其余各組間差異顯著(P<0.05);水分對(duì)米曲霉培養(yǎng)物的總酶活力有顯著的影響(P<0.05),多重比較結(jié)果顯示,加水量為10.0mL和7.5mL組間差異不顯著(P>0.05),其余各組間差異顯著(P<0.05)。2.6pahs對(duì)產(chǎn)酶的影響發(fā)酵培養(yǎng)基中添加各種無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶影響的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出,KNO3和MgSO4對(duì)米曲霉產(chǎn)生中性蛋白酶有明顯的促進(jìn)作用,其相對(duì)酶活力分別達(dá)152.9%、146.3%。Na2HPO4和(NH4)2SO4對(duì)產(chǎn)酶也有一定促進(jìn)作用,K2HPO4、CaCO3、KH2PO4和ZnSO4對(duì)產(chǎn)酶的影響不大,而FeSO4對(duì)產(chǎn)酶有明顯的抑制作用,其相對(duì)酶活力僅為68.7%。方差分析結(jié)果表明,添加無(wú)機(jī)鹽類(lèi)后對(duì)米曲霉產(chǎn)酶能力有顯著的影響(P<0.05),多重比較結(jié)果顯示,添加KNO3、MgSO4、Na2HPO4和(NH4)2SO4與對(duì)照組間差異顯著(P<0.05),添加其他無(wú)機(jī)鹽組與對(duì)照組間差異不顯著(P>0.05)。2.7接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明:接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響很大,隨著接種量增加,酶活力不斷增加,在接種量為每10g培養(yǎng)基1×108個(gè)孢子時(shí)產(chǎn)酶活力最高,但當(dāng)接種量繼續(xù)增加時(shí),酶活力反而有所下降,可能是由于接種量太大,營(yíng)養(yǎng)缺乏,抑制了蛋白酶的產(chǎn)生。方差分析結(jié)果表明接種量對(duì)產(chǎn)酶能力有顯著的影響(P<0.05),多重比較結(jié)果顯示,各實(shí)驗(yàn)組與接種量為1×108組間差異顯著(P<0.05)。2.8培養(yǎng)基的濃度在自然通風(fēng)條件下,不同培養(yǎng)基組成下米曲霉產(chǎn)蛋白酶的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明:當(dāng)培養(yǎng)基中m(麩皮)∶m(豆粕)為4∶1時(shí),酶活力最高,并隨著豆粕的含量增高,酶活力反而下降,培養(yǎng)基全為麥麩時(shí),酶活力仍較高?？赡芘c培養(yǎng)基的碳氮比有關(guān),以及與豆粕為粉狀制成培養(yǎng)基時(shí),透氣性較差,而麥麩為薄片狀,制成培養(yǎng)基時(shí),透氣性較好有關(guān)。方差分析結(jié)果表明培養(yǎng)基組成對(duì)米曲霉產(chǎn)酶能力有顯著的影響(P<0.05),多重比較結(jié)果顯示,m(麩皮)∶m(豆粕)為1∶4和2∶3,4∶1和5∶0組間差異不顯著(P>0.05),其余各組間差異顯著(P<0.05)。2.9中性蛋白酶的最佳培養(yǎng)溫度優(yōu)化條件后米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的產(chǎn)酶曲線見(jiàn)圖3。從圖3可看出,在最適培養(yǎng)條件下,米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的量達(dá)到了3999.2U·g-1,比實(shí)驗(yàn)初期的1103.4U·g-1提高了2倍多,達(dá)到最高酶活力的時(shí)間也由原來(lái)的60h提前到了48h。3中性蛋白酶的培養(yǎng)綜上所述,米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的適宜培養(yǎng)條件為:m(麩皮)∶m(豆粕粉)=4∶1,水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%,培養(yǎng)基中各無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:KNO30.2%,MgSO40.05%,Na2HPO40.13%,pH值為6.0,接種量為每10g培養(yǎng)基接種1.0×108個(gè)孢子,最佳培養(yǎng)溫度為30℃,最佳培養(yǎng)時(shí)間為48h。在此培養(yǎng)條件下,最高酶活力達(dá)3999.2U·g-1,比吳虹在培養(yǎng)基中添加植酸質(zhì)時(shí)培養(yǎng)瀘釀3.042號(hào)米曲霉的最高酶活力3588U·g-1稍高,但低于邱雁臨等利用米曲霉AOI