濃香型白酒發(fā)酵糟中還原糖測定方法的研究

濃香型白酒發(fā)酵糟中還原糖測定方法的研究

濃香酒是一種奇怪的酒，在中國酒精飲料中占有重要地位。傳統(tǒng)濃香型白酒采用固態(tài)法釀酒,糖化和發(fā)酵在發(fā)酵糟醅中同時進行,形成了棲息在窖池糟醅、窖泥中的龐大微生物區(qū)系在糟醅固、液、氣三相界面間的復雜物質、能量代謝和信息傳遞過程。在這一過程中,淀粉質釀酒原料降解和轉化為可發(fā)酵糖(主要為還原糖)并生成乙醇,同時還生成高級醇、有機酸、酯類、醛類、酮類以及其他一些大分子物質。因此,發(fā)酵糟醅中糖類的動態(tài)變化不僅間接反應窖池中乙醇的生成情況和發(fā)酵狀況,而且可以特征反映窖池中微生物的生命活動狀況。在一般發(fā)酵工業(yè)及傳統(tǒng)釀造企業(yè),包括質量技術檢驗部門,測糖的經(jīng)典化學方法是斐林試劑(Fehling)法,如Lane—Eylon法和Bertrand法。該方法具有準確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點,但步驟多、操作繁,對操作人員熟練程度要求較高,否則易造成較大誤差。而分光光度法不僅操作簡便,與其他儀器分析方法(如HPLC法,電極電位測定法,流動注射分析法)相比,不需高檔分析測試儀器,準確度也能達到分析要求,并且能用于半微量或微量分析,近年來在糖類測定中應用較多。但對不同的顯色原理,選定的顯色劑各不相同;而且對于同一種顯色劑,如3,5-二硝基水楊酸(簡稱DNS),也會因不同測定樣品中一些物質會對還原產(chǎn)物產(chǎn)生吸光干擾,檢測時選定的測定波長也各不相同。在對白酒發(fā)酵糟醅的研究中,利用3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖時,如何消除白酒發(fā)酵糟醅中的干擾物質影響,建立快速、準確的測定方法,對于監(jiān)控窖池發(fā)酵糟醅發(fā)酵狀況,指導白酒生產(chǎn)以及進一步研究窖池的物質能量轉化關系具有重要的意義。1材料和方法1.1材料表面分析樣品:四川瀘州老窖酒廠發(fā)酵糟醅。1.2主要設備721型分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)酸度計(pHS-25C,上?？祪x儀器有限公司)1.3ds顯色劑的配制0.01g/mL葡萄糖標準溶液:準確稱取預先在105℃烘至恒重的葡萄糖0.50g,用水溶解后移于50mL容量瓶中并稀釋至刻度。DNS顯色劑。以上試劑均為分析純。1.4實驗方法1.4.1樣品預處理還原糖樣液:取發(fā)酵糟醅約10g加100mL蒸餾水制成懸震液,抽濾得到濾液,中和至pH6左右,定容至100mL。1.4.2最大波長od測定取1mL樣液和2mLDNS顯色劑分別加入1mL水中,沸水浴5min,取出迅速冷卻,稀釋1倍,以水作參比液,分別在500～650nm波長范圍測定OD值。作OD值-波長曲線,選擇參比液。1.4.3波長為400mn的多步參比液mL待測液于試管中,加入3,5-二硝基水楊酸4mL,同1.4.2步操作,以1.4.2步所選定的參比液,在波長480nm～650nm測OD值。作OD值-波長曲線,選擇最大吸收波長。1.4.4最大吸收波長法取待側液2mL各加入1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mLDNS顯色劑,同1.4.2步操作,以1.4.3步所選定的最大吸收波長測定OD值。作OD值—DNS用量關系圖,選擇顯色劑最佳用量。1.4.5標準曲線的繪制參考文獻繪制方法,于1.4.3處所選定的波長處測OD值,繪制OD值—濃度標準曲線。2結果與討論2.1品液預處理方法對還原糖測定結果的比較在樣品懸震、浸出時,考慮到樣品中微生物菌體及酶的存在對處理過程中還原糖含量的可能影響,實驗中比較了樣品液煮沸方法與原不煮沸方法對還原糖測定結果的差異,兩種預處理方法的比較結果如表1所示:從表1可以看出兩種方法的測定結果誤差在0.5%之內,幾乎無明顯變化。估計是由于樣品液處于較酸性(pH3.5)的環(huán)境條件下,還原糖含量難于被被微生物、酶等生化因素所影響。因而,采用本文1.4.1不煮沸的預處理方法是可行的。2.2樣品液和dna的od測定正確選擇參比溶液可以使試液的吸光度真正反映待測物的濃度。在樣品液中帶有醛基的非還原糖物質以及含氨基的物質對測定結果有較大影響,因此分別選擇DNS和樣品液,以水作參比在500～650nm波長范圍內測定吸光度,結果如圖1。由圖1可以看出,樣品液和DNS的OD值均在測定范圍內隨波長增大而降低,且在590nm～650nm波長范圍內,二者的OD值都很小,不會對還原產(chǎn)物的OD值造成較大的干擾。相對而言,樣品液的OD值比DNS的OD值略大一些,因而在還原糖分析測定中,可在590nm～650nm波長范圍內選擇樣品液作為參比液使用。2.3顯色劑用量對sds值的影響在顯色反應中,根據(jù)溶液平衡原理顯色劑過量愈多對反應越有利,但是過量的顯色劑可能會在樣品液中引起副反應。因此在樣品液濃度和其他測定條件固定的狀態(tài)下,加入不同量的DNS,在590nm～650nm波長范圍內,選擇吸光度最低的600nm波長測定DNS顯色劑的OD值,結果如圖2。從圖2中的曲線可見,加入的DNS在4mL以下,隨DNS用量增加,樣品反應液的吸光度呈逐漸上升的趨勢,說明參與反應的顯色劑用量不足。當顯色劑用量增加到4mL～6mL時,測定的樣品反應液OD值已達到最大并基本穩(wěn)定不變。因而,可以認為,測定時2mL樣品液中加入顯色劑DNS的最佳用量是4.0mL,即樣品液于DNS顯色劑的用量比為1∶2。2.4od值在樣品的最大吸收波長選取中,以樣品液作參比,取4mLDNS加入到2mL樣品液中,在570nm～650nm范圍內測定OD值,還原糖與顯色劑反應后在不同波長下的吸光度曲線如圖3所示。在570nm～650nm波長范圍內,樣品液中還原糖和DNS反應后產(chǎn)物的OD值表現(xiàn)出較好的波形曲線,并在波長610nm處有最大吸收峰,因此,發(fā)酵糟醅還原糖測定實驗中,選取610nm作為測定用波長最為合適。2.5還原糖濃度曲線的測定按1.4.5標準曲線繪制方法,配制系列不同濃度標準溶液。以水作參比,分別取4mLDNS各加入到2mL系列濃度的標準溶液中,測定OD值,作OD值-還原糖濃度曲線。結果如圖4。圖4表明:曲線的線性相關性非常好,對曲線作回歸分析得相關系數(shù)R=0.9996,回歸方程式Y=1.0412X+0.0027,其中Y表示還原糖的濃度,單位g%;X表示測定的吸光度A;0.0027表示補償參數(shù)。3還原糖含量的測定用3,5-二硝基水楊酸—分光光度法分析濃香型白酒發(fā)酵糟醅中的糖分含量時,以樣品液作為測定的參比液,樣品液與DNS顯色劑的用量比為1∶2,在610nm處測定OD值,經(jīng)回歸方程式Y=1.0412X+0.0027可快速