米曲霉滬餾302固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)白腐菌的研究

米曲霉滬餾302固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)白腐菌的研究

美沙梅是中國(guó)傳統(tǒng)的加工食品品種，如酒精食品和餐飲。人們知道美國(guó)的米曲霉菌生產(chǎn)了許多酶系統(tǒng)和復(fù)雜的酶系。日本的研究人員發(fā)現(xiàn)了美沙霉組。然而，關(guān)于這類(lèi)植物在中國(guó)的酶系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中受到的影響及其酶系統(tǒng)的影響尚不清楚。另一方面，在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，美國(guó)的霉菌生產(chǎn)過(guò)程無(wú)法得到很好的控制。另一方面，這類(lèi)傳統(tǒng)植物在工業(yè)應(yīng)用中的地位還沒(méi)有完全擴(kuò)大。本實(shí)驗(yàn)對(duì)米曲霉（Aspergillusoryzae)M-9的3種主要酶在固體發(fā)酵過(guò)程中所受的影響及活性的變化進(jìn)行了研究，探討利用木質(zhì)纖維原料低成本生產(chǎn)酶系豐富的工業(yè)酶制劑的可行性，同時(shí)為深入了解這些酶在食品釀造過(guò)程中的作用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1米曲霉的分離米曲霉（Aspergillusoryzae)M-9，運(yùn)用透明圈法從王致和集團(tuán)公司提供的米曲霉滬釀3.042的曲精中篩選分離而來(lái)，以PDA斜面培養(yǎng)基30℃～32℃恒溫培養(yǎng)并保存。1.2培養(yǎng)基和膏樺木木聚糖、低黏度羧甲基纖維素：購(gòu)于Sigma公司；酪蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏：購(gòu)自北京雙旋培養(yǎng)基制造廠；蔗渣、玉米芯及麩皮：購(gòu)自北京郊區(qū)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.3培養(yǎng)基培養(yǎng)方法制備孢子懸液：將10mL無(wú)菌水加入到在30℃條件下培養(yǎng)了3d～4d的PDA斜面培養(yǎng)基，用滅菌的接種環(huán)在培養(yǎng)基表面輕輕刮動(dòng)，制成孢子懸液，混勻后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)孢子數(shù)，調(diào)整孢子懸液的孢子數(shù)為106個(gè)/mL。營(yíng)養(yǎng)鹽溶液：KH2PO41g/L、NaCl2.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、（NH4)2SO41g/L、CaCl20.5g/L，調(diào)節(jié)pH值至7.0。發(fā)酵培養(yǎng)：在250mL三角瓶中加入5g風(fēng)干后過(guò)篩的木質(zhì)纖維原料和15mL營(yíng)養(yǎng)鹽溶液，拌勻，121℃滅菌30min，冷卻后按每瓶固體培養(yǎng)基1mL孢子懸液（106個(gè)/mL）接種，攪拌均勻后，于32℃培養(yǎng)72h。粗酶液的制備：每克固態(tài)培養(yǎng)物加入5.0mL、pH7.2的磷酸緩沖溶液，室溫下浸提1h,10000×g離心10min，上清液即為粗酶液。1.4酪氨酸的測(cè)定蛋白酶活性的測(cè)定參照FERREIAG等的方法：1.0mL適當(dāng)稀釋的酶溶液，加入到1.0mL用0.1mol/L、pH7.0檸檬酸鈉緩沖液配置的1%酪蛋白底物溶液中，40℃反應(yīng)10min，用0.5mL0.3mol/L三氯醋酸溶液中止反應(yīng)。反應(yīng)液混勻后8000×g離心10min，釋放的酪氨酸按照LOWRYOH方法等的測(cè)定，同時(shí)以酪氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白酶活性單位（U）的定義為：在上述條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μmol酪氨酸所需的酶量。木聚糖酶活性的測(cè)定參照DNS法：0.1mL適當(dāng)稀釋的酶溶液，加入到0.9mL用0.05mol/L、pH6.5檸檬酸鈉緩沖液配制的1%樺木木聚糖底物溶液中，50℃反應(yīng)5min，用DNS法測(cè)定釋放的還原糖量，同時(shí)以木糖作標(biāo)準(zhǔn)。木聚糖酶活力單位（U）的定義為：在上述條件下，每分鐘水解木聚糖生成1μmol木糖所需的酶量。纖維素酶活性：方法同上，僅將底物和標(biāo)準(zhǔn)物分別換成低粘度羧甲基纖維素和葡萄糖。纖維素酶活性單位（U）的定義為：在上述條件下，每分鐘水解低黏度羧甲基纖維素生成1μmol葡萄糖所需的酶量。2結(jié)果與討論2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析采用蔗渣、玉米芯、作麩皮作為單一碳源進(jìn)行固體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。在所選碳源中，麩皮作為碳源米曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶及木聚糖酶量均相對(duì)較高，玉米芯作為碳源時(shí)產(chǎn)酶量稍低，而蔗渣作為碳源時(shí)產(chǎn)酶效果最差。2.2發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果微生物酶的合成同時(shí)受酶誘導(dǎo)物和酶蛋白質(zhì)前體的調(diào)控，酶誘導(dǎo)物一般為可利用的碳源，而酶蛋白質(zhì)的前體主要來(lái)自于氮源，因此氮源的類(lèi)型和性質(zhì)同樣會(huì)影響酶的合成和分泌。選擇不同氮源作為單一氮源進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，來(lái)考察對(duì)米曲霉產(chǎn)酶的影響。結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可看出，氮源對(duì)米曲霉蛋白酶生產(chǎn)的影響很大。在實(shí)驗(yàn)選用的8種有機(jī)和無(wú)機(jī)氮源中，以蛋白胨作為單一氮源時(shí)米曲霉所產(chǎn)蛋白酶活性最高；酪蛋白胨和酵母浸膏次之，米曲霉所產(chǎn)蛋白酶分別是蛋白胨作為單一氮源時(shí)活性的94%和91%；當(dāng)分別以硫酸銨和氯化銨為單一氮源時(shí)，米曲霉所產(chǎn)蛋白酶活性僅為最高酶活性的32%和21%。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)米曲霉所產(chǎn)的木聚糖酶和纖維素酶受氮源影響的程度與其蛋白酶并不同步：尿素是其產(chǎn)生最高木聚糖酶活性及纖維素酶活性的一種氮源，而在此條件下米曲霉僅能產(chǎn)生相對(duì)最高活性71%的蛋白酶。2.3初始ph值對(duì)米曲霉蛋白酶表達(dá)的影響微生物在生長(zhǎng)繁殖和代謝過(guò)程中，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被分解利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，而培養(yǎng)基初始pH值不僅影響微生物的生長(zhǎng)繁殖，且對(duì)其產(chǎn)酶情況有顯著的影響。在優(yōu)化碳氮源基礎(chǔ)上，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值為5.0～9.0來(lái)考察對(duì)米曲霉產(chǎn)酶的影響，結(jié)果（圖1A）表明，米曲霉產(chǎn)生蛋白酶的最佳培養(yǎng)基初始pH值為6.0～8.0，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為5.0，米曲霉仍能產(chǎn)生相對(duì)于最高活性72%的蛋白酶；而當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值調(diào)至9.0時(shí)，米曲霉產(chǎn)生蛋白酶量則迅速下降至最高活性的34%，表明米曲霉產(chǎn)蛋白酶雖可在較寬的培養(yǎng)基初始pH值范圍內(nèi)，但堿性環(huán)境不利于米曲霉蛋白酶的生產(chǎn)。盡管米曲霉木聚糖酶和纖維素酶的產(chǎn)生也在一定程度上受到培養(yǎng)基初始pH值的影響，但是與米曲酶蛋白酶相比較，一方面其受影響的程度低于蛋白酶，另一方面米曲霉產(chǎn)生此2種酶的最佳培養(yǎng)基初始pH值范圍屬于中性偏堿，如纖維素酶活性在pH8.0時(shí)達(dá)最高。另外，在調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值至最佳的基礎(chǔ)上考察了培養(yǎng)溫度對(duì)米曲霉產(chǎn)酶的影響，結(jié)果（圖1B）表明，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)菌株所產(chǎn)酶活性最高；當(dāng)溫度升高至45℃時(shí)，蛋白酶活性僅為最高值的35%，木聚糖酶和纖維素酶活性也分別降至最高值的46%和51%?？芍?0℃條件下較為利于米曲霉的菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)酶。2.4米曲霉的蛋白酶特性在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，米曲霉固體發(fā)酵的產(chǎn)酶過(guò)程見(jiàn)圖2。由圖2可知，從培養(yǎng)24h開(kāi)始米曲霉開(kāi)始蛋白酶的迅速合成，至培養(yǎng)48h時(shí)產(chǎn)生最高活性的蛋白酶，隨后產(chǎn)酶量迅速下降至最高值的50%。米曲霉產(chǎn)生木聚糖酶和纖維素酶的趨勢(shì)與蛋白酶基本一致。國(guó)內(nèi)醬油生產(chǎn)中滬釀3.042米曲霉的制曲時(shí)間為36h～42h，也是由于在此時(shí)間段米曲霉菌所產(chǎn)各種酶處于高峰期。2.5米曲霉酶系統(tǒng)成分的初步檢測(cè)在不同條件下對(duì)米曲霉的產(chǎn)酶酶系進(jìn)行分析，測(cè)試條件及結(jié)果（表3）表明，米曲霉在實(shí)驗(yàn)所采用的固體發(fā)酵條件下的產(chǎn)物中，中性蛋白酶的量最大，除此之外，還有一定量的堿性蛋白酶及酸性木聚糖酶、纖維素酶。3初始ph值及培養(yǎng)溫度對(duì)菌株發(fā)酵的影響研究了米曲霉菌株M-9發(fā)酵條件及酶系分析。實(shí)驗(yàn)表明，此菌株固態(tài)發(fā)酵最適碳源為麩皮，最適氮源為蛋白胨，菌株發(fā)酵最適