家畜性別控制的研究與應(yīng)用

家畜性別控制的研究與應(yīng)用

性別控制是指通過人工控制法將成年動(dòng)物繁殖所獲得的雌性和雄性動(dòng)物的生物技術(shù)。實(shí)現(xiàn)家畜的性別控制,意義重大,主要體現(xiàn)在:①能及時(shí)淘汰或終止不需要性別的動(dòng)物,提高畜牧業(yè)生產(chǎn)效益(奶牛、奶山羊、蛋雞雌性后代價(jià)值高,雄性價(jià)值低;肉牛、肉豬、肉雞雄性生長速度快);②在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)中,提高所需性別的利用價(jià)值(雌性動(dòng)物利用價(jià)值高,雄性動(dòng)物利用價(jià)值低);③避免胚胎移植異性胚胎導(dǎo)致的孿生不育;④增加所希望的性別動(dòng)物的比例,提高選種強(qiáng)度;⑤預(yù)測(cè)性別,預(yù)防伴性遺傳病的發(fā)生等。隨著分子遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)及其他相關(guān)學(xué)科的發(fā)展,家畜的性別控制提高到了分子水平且進(jìn)展迅猛。筆者就性別控制的生物學(xué)機(jī)制、途徑、方法及其在家畜育種中的應(yīng)用作一綜述。1y染色體決定睪丸1902年,McClung在研究蝗蟲精細(xì)胞時(shí),首次提出了性別決定的染色體理論。Lush(1925)進(jìn)行了早期性別控制研究,用分離的兔X和Y精子受精,但后代的性別比例無顯著改變。隨著細(xì)胞遺傳學(xué)的發(fā)展,性控技術(shù)有了實(shí)質(zhì)性突破。Welshons等(1959)和Jacobs等(1959)發(fā)現(xiàn)并提出了Y染色體決定雄性的理論,此后隨著人工授精和胚胎移植技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,性別控制的研究出現(xiàn)了高潮。Sinclair等(1990)和Gubbay等(1990)發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物(包括人)Y染色體短臂上靠近常染色體區(qū)的35kb區(qū)域存在性別決定區(qū)(SRY)。Koopman等(1991)將含有SRY基因的14kbY染色體片段顯微注入雌性小鼠(XX)胚胎中,結(jié)果小鼠發(fā)育成雄性,從而證明了SRY為哺乳動(dòng)物的性別決定基因。SRY編碼的基因產(chǎn)物稱為睪丸決定因子(TDF),能使性腺發(fā)育成為睪丸。睪丸形成后,其間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮產(chǎn)生雄性結(jié)構(gòu),支持細(xì)胞分泌抗苗勒氏管因子(AMDF),抑制苗勒氏管發(fā)育。如沒有Y染色體存在,性腺原基發(fā)育為卵巢,由卵巢產(chǎn)生的雌激素能使苗勒氏管(MD)發(fā)育為雌性結(jié)構(gòu)。小鼠的研究結(jié)果表明,Y染色體上的SRY基因必須有某些常染色體基因的協(xié)調(diào)才能發(fā)揮作用。2第二,賦予體外人性別,即控制性別性別控制途徑主要有3種:①在受精之前,通過體外對(duì)精子進(jìn)行干預(yù),使在受精之時(shí)便決定后代的性別,從而達(dá)到控制性別的目的。②在受精之后,通過對(duì)胚胎的性別進(jìn)行鑒定,從而獲得所需性別的后代。③通過控制外環(huán)境來控制性別,如通過控制受精前母畜子宮的內(nèi)環(huán)境,抑制Y染色體與卵子結(jié)合,達(dá)到控制性別的目的。飼養(yǎng)者可以根據(jù)自己實(shí)際情況,選擇合適的性別控制技術(shù)加以實(shí)施,以提高經(jīng)濟(jì)效益。2.1精子的性別控制試驗(yàn)人們已確認(rèn)動(dòng)物的性別是由X和Y染色體決定的。X精子與Y精子間存在著微弱的生物學(xué)差異,如根據(jù)精子的形態(tài)、比重、膜電荷、抗原性、對(duì)酸堿的敏感性、運(yùn)動(dòng)性等不同(王念功,1992)進(jìn)行試驗(yàn),把它們分開,然后進(jìn)行人工授精,達(dá)到性別控制的目的。2.2抗高血壓胚胎發(fā)育胚胎移植技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)大量地應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中。人們對(duì)早期胚胎利用特異性DNA探針或PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定,然后按要求選擇特定胚胎,移植給受體,正常發(fā)育為預(yù)定性別的個(gè)體(羅應(yīng)榮等,2005;王建國等,2009)。2.3自然交配情況性別主要是由遺傳決定的,即由X、Y性染色體與常染色體的對(duì)比關(guān)系決定的。在自然交配的情況下,精子在母畜生殖道運(yùn)行和受精過程中所處環(huán)境的差異將對(duì)后代的性別產(chǎn)生一定影響。此外,外界環(huán)境中的某些因素也可能不同程度地影響胚胎性別的發(fā)育,從而改變性別。3性別檢測(cè)方法3.1x、y精子研究Lush(1925)用分離的兔X和Y精子受精,進(jìn)行了早期性別控制研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),后代的性別比例無顯著改變。隨后,人們逐漸開展了X、Y精子在物理和化學(xué)等方面差異的研究。早期分離精子主要采用物理分離法(包括沉降法、電泳法等),后來又發(fā)展起來免疫學(xué)分離法和流式細(xì)胞分離法。3.1.1用x精子濃度檢測(cè)牛精沉降法的原理是X精子沉積速率比Y精子快。White(1984)將活力4級(jí)以上綿羊精液靜止2h,取上層受精,母羔率達(dá)63%。曹世禎等(2000)曾用此方法處理牛精液,將認(rèn)為富含X精子的部分收集起來并給母牛輸精,結(jié)果發(fā)現(xiàn),母牛所產(chǎn)雌性牛犢的比例為65.4%。沉降法是以比重的不同為基礎(chǔ)。X精子與Y精子的比重雖然有所不同,但差異并不大,且比重會(huì)隨精子的成熟情況不同而有變化,所以沉降法的效果并不是十分理想。3.1.2x與y精子電泳精子膜電荷的大小取決于與核蛋白結(jié)合的唾液酸含量,X與Y精子膜電荷的分布有一定差異。Y精子是尾部膜電荷量較高,而X精子頭部膜電荷較高。當(dāng)以中性緩沖液電泳時(shí),向陽極運(yùn)動(dòng)的X精子比Y精子多。因此,根據(jù)精子表面帶電荷量不同,通過電泳可以將X與Y精子分離。Shroedom(1932)就報(bào)道了利用電泳法分離牛的精子,但近年來人們通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),電泳法準(zhǔn)確率較低,重復(fù)性較差。3.1.3x、y精子的分離免疫法是利用免疫反應(yīng)識(shí)別X和Y精子達(dá)到控制性別的目的。Zavos(1983)將H-Y抗血清直接注射到兔陰道內(nèi),得到的雄性率高達(dá)74.2%。Jones等(1992)用免疫磁力選擇法成功高效地分離出X、Y精子。目前使用的免疫抗原主要是H-Y抗原,H-Y抗原被保留在整個(gè)進(jìn)化過程中,除了某些過渡品種外,在所有異形配子的性別品種的體細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)H-Y抗原的存在,并且只有Y精子才能表達(dá)H-Y抗原,因此將精子分離成為H-Y(Y精子)和H-Y(X精子);此法簡便快速、成本低,但是對(duì)精子處理的時(shí)間較長,影響精子活力,可導(dǎo)致受胎率下降,因此推廣應(yīng)用具有一定難度。3.1.4精子分離和借鑒流式細(xì)胞分離法借助于流式細(xì)胞光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定,其依據(jù)是精子的DNA含量不同。X精子DNA含量比Y精子高,吸收的染料多,發(fā)生的熒光也強(qiáng),反之亦然。放射出的信號(hào)通過儀器和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)擴(kuò)增,分析并分解出X、Y精子。流式細(xì)胞分離法開創(chuàng)了精子分離的新局面。Seidl等(1997)報(bào)道用流式細(xì)胞分離法分離奶牛精子,用X精子輸精后所產(chǎn)下犢牛的性別準(zhǔn)確率為83%,而Y精子為90%。王建國等(2006)采用流式細(xì)胞分離法獲得的性控凍精對(duì)奶牛進(jìn)行人工授精,母犢出生準(zhǔn)確率為93.3%,極顯著高于普通凍精的母犢率。盧克煥等(2006)采用流式細(xì)胞分離法獲得世界首例分離精子性別控制的試管水牛。盧克煥等(2009)又利用流式細(xì)胞分離法獲得國內(nèi)首批性別控制的仔豬,仔豬性別與預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率達(dá)100%。3.2胚胎性別鑒定胚胎性別鑒定主要是通過鑒定胚胎的性別,以影響出生的性別比例。早期胚胎性別鑒定方法主要有細(xì)胞學(xué)方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法等。3.2.1xy模型細(xì)胞學(xué)方法是經(jīng)典的胚胎性別鑒定方法。胚胎的核型是固定的(XX或XY),家畜的染色體在早期胚胎發(fā)育過程中雌性胚胎中的一條X染色體處于暫時(shí)失活狀態(tài)。因此,從胚胎取出部分細(xì)胞直接進(jìn)行染色體分析或阻斷培養(yǎng)在細(xì)胞分裂中期進(jìn)行染色體分析,可對(duì)胚胎進(jìn)行性別鑒定。3.2.2間接免疫熒光法免疫學(xué)方法是利用H-Y抗血清或H-Y單克隆抗體檢測(cè)胚胎上是否存在雄性特異性H-Y抗原,從而鑒定出胚胎性別的一種方法。常用的檢測(cè)胚胎H-Y抗原的方法是間接免疫熒光法。將胚胎在H-Y抗血清或單克隆抗體中培養(yǎng),再用異硫氰酸鹽熒光素(FITC)標(biāo)記的二抗處理,在熒光顯微鏡下觀察有無特殊熒光,有熒光者為雄性胚胎,無熒光者為雌性胚胎。3.2.3牛囊胚期胚胎的鑒定分子生物學(xué)方法是近年來發(fā)展起來的一種通過檢測(cè)Y染色體上是否存在SRY基因來鑒別家畜胚胎性別的嶄新方法,有則判斷為雄性,無則判斷為雌性,主要包括DNA探針法和PCR擴(kuò)增法。DNA探針法:從家畜胚胎上取少量細(xì)胞,將其DNA與Y染色體特異標(biāo)記的DNA序列(探針)雜交,結(jié)果顯示陽性則為雄性胚胎,否則為雌性胚胎。Leonard等(1987)首次報(bào)道用牛Y染色體特異性DNA多重復(fù)序列探針鑒定牛囊胚期胚胎獲得成功,準(zhǔn)確率為95%。PCR擴(kuò)增法:通過合成家畜SRY基因片段的寡聚核苷酸片段為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,能擴(kuò)增出特異SRY序列的為雄性,反之為雌性,其準(zhǔn)確率可達(dá)95%～100%。2000年上海市醫(yī)學(xué)遺傳研究所曾溢滔院士和黃淑禎教授首次應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)奶牛胚胎的SRY基因,成功進(jìn)行了奶牛和山羊冷凍胚胎的SRY基因檢測(cè)和選擇移植,大大提高胚胎性別鑒定的實(shí)用性。曹越等(2003)建立了全套式PCR對(duì)牛胚胎性別鑒定的方法,用于檢測(cè)牛早期胚胎性別,對(duì)提高移植成功率極為重要。3.3控制從奶牛到外部環(huán)境的控制家畜外部環(huán)境中的某些因素也是性別決定機(jī)制的重要條件,主要包括營養(yǎng)、體液酸堿度、溫度、輸精時(shí)間、年齡胎次、激素水平等。4漁家性別控制目前,家畜性別控制的方法很多,但在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用都有一定的局限性。采用物理方法分離X、Y精子,雖有成功的報(bào)道但重復(fù)性差,在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用的意義不大,因此對(duì)物理分離法的研究相對(duì)減少。家畜性別控制研究的熱點(diǎn)主要集中在流式細(xì)胞分離法和胚胎性別的分子生物學(xué)鑒定上;但流式細(xì)胞儀法因分離速度慢而影響其在生產(chǎn)中的應(yīng)用;PCR方法