雪白根霉脂肪酶基因在畢赤酵母中的高效表達及其酶學性質研究

PAGE——————珠海市科技攻關及高新技術產業(yè)化（2012D0201990042）雪白根霉脂肪酶基因在畢赤酵母中的高效表達及其酶學性質研究王建榮，劉丹妮，李鵬，劉金山，周平發(fā)，陳麗芝，聶金梅，鐘開興，李陽源*（廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東珠海，519060）摘要：采用同源克隆法獲得了雪白根霉的脂肪酶基因（rnl），將其連接到pPICZαA載體上，得到重組表達載體pPICZαA-rnl。將表達載體pPICZαA-rnl用限制性內切酶SacI線性化后，電擊轉入畢赤酵母X-33中。雪白根霉脂肪酶基因在畢赤酵母X-33中成功表達，重組菌株搖瓶培養(yǎng)144h后，酶活可達48U/mL。重組酶最適pH值為8.5，最適反應溫度為35℃。1mmol/L的Mn2+,Ca2+和K+以及1%的表面活性劑吐溫20，吐溫80，曲通100對重組脂肪酶具有激活作用。重組酶的最適底物為三月桂酸甘油酯（C12）關鍵詞：雪白根霉，脂肪酶，畢赤酵母X-33脂肪酶（Lipase，E.C.），全稱為三酰基甘油酰水解酶（triacylglycerolacylhydrolase），它屬于α/β折疊酶家族，是一種絲氨酸水解酶。脂肪酶可以在油水界面上催化天然底物油脂水解,釋放更少酯鍵的甘油酯或甘油及脂肪酸，而在非水相體系中脂肪酶還可催化轉酯和酯合成等多種反應[1]。脂肪酶作為一種重要的工業(yè)酶被廣泛的應用到食品加工、洗滌、醫(yī)藥等領域。脂肪酶廣泛的存在于動植物和微生物中，相對于動植物，微生物分泌的脂肪酶具有很多的優(yōu)勢：如微生物分泌的脂肪酶一般都為胞外酶，更適合工業(yè)化大生產；微生物來源的脂肪酶具有更廣的作用溫度范圍、作用pH以及底物專一性[2-3]。隨著國內外對脂肪酶研究的深入，越來越多的微生物脂肪酶被發(fā)掘出來。微生物脂肪酶主要分為細菌脂肪酶和真菌脂肪酶兩大類，細菌脂肪酶研究較多的是假單胞菌屬脂肪酶[4]，真菌脂肪酶的研究主要集中在根霉屬和酵母屬兩大類[5-6]。相對于其他微生物來源的脂肪酶，根霉屬脂肪酶具有高度的1、3位置專一性和立體選擇性。在根霉脂肪酶中，來源于米根霉的脂肪酶被廣泛應用于生物柴油的生產[7-8]；來源于華根霉的脂肪酶主要應用于烘焙食品、有機合成等領域[9-10]；相對于以上兩種根霉脂肪酶，雪白根霉脂肪酶主要應用于油脂加工、改性等領域[11-12]。為了進一步提高雪白根霉脂肪酶（RNL）的酶活及改善其酶學性質，許多學者開始應用分子生物學的方法研究其脂肪酶基因的克隆、表達、調控等。迄今，雪白根霉脂肪酶基因已經在釀酒酵母中實現(xiàn)了異源表達[13]。相對于釀酒酵母表達系統(tǒng)，畢赤酵母表達系統(tǒng)具有更多的優(yōu)勢：培養(yǎng)條件簡單、易于操作便于工業(yè)化生產；高穩(wěn)定性表達，可高效的表達外源蛋白等[14]。到目前為止，還沒有關于雪白根霉脂肪酶基因在畢赤酵母進行表達的研究報道。本研究首次將雪白根霉脂肪酶基因在畢赤酵母中進行了異源表達并且測定了重組雪白根霉脂肪酶（RNL）的酶學性質，為下一步對雪白根霉脂肪酶基因進行基因改造以及高密度發(fā)酵重組雪白根霉脂肪酶酵母工程菌奠定基礎。1.材料與方法1.1材料與試劑表達載體pPICZαA、畢赤酵母X-33，博萊霉素，購自美國Invitrogen公司。大腸桿菌Top10，高保真Pfu酶、T4DNA連接酶、限制性內切酶EcoRI、XbaI、質粒提取試劑盒、真菌基因組提取試劑盒、PCR純化試劑，購自上海生工公司；不同碳鏈長度的脂肪酶底物，購自美國Sigma公司；其他常規(guī)試劑均為國產分析純或進口分裝；引物由深圳華大基因合成。大腸桿菌用LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，酵母轉化子分別用YPDZ和羅丹明B培養(yǎng)基進行篩選，酵母搖瓶培養(yǎng)及產酶培養(yǎng)基分別為BMGY和BMMY。LB、YPDZ、BMGY和BMMY培養(yǎng)基分別參照Invitrogen公司的酵母表達手冊進行配置。羅丹明B培養(yǎng)基的配方為：在YPD培養(yǎng)基的基礎上加入2×10-4%（w/v）的羅丹明B和1%（v/v）的橄欖油。1.2儀器與設備PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、冷凍離心機，珠海黑馬科技有限公司；電穿孔儀，美國Bio-Rad公司；脂肪酶活性測定酸堿滴定儀，瑞士Metrohm公司；1.3雪白根霉脂肪酶基因克隆及表達載體的構建1.3.1雪白根霉基因組DNA的提取挑取雪白根霉菌絲體，接入50mLPDA液體培養(yǎng)基中，30℃，200r/min培養(yǎng)3天，離心取菌體，參照真菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。用微量紫外分光光度計測定DNA的濃度，選取A260/A280值在1.8~2.0的樣品于-201.3.2雪白根霉脂肪酶基因克隆據文獻報道[13]，雪白根霉的脂肪酶基因不含有內含子，因此可以以雪白根霉的基因組DNA為模板，通過PCR的方法擴增rnl。經過分析NCBI上已報道的rnl的全基因組DNA序列（Genebank登錄號為：AB013496），設計了一對引物，上游引物：5'-CAGCGAATTCATGGTTTCATTCATTTCCATT-3'和下游引物：5'-GACGTCTAGATTACAAACAGCTTCCTTCGTT-3'（分別含有EcoRI和XbaI酶切位點）。以提取的雪白根霉基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系：DNA模板1μL（約50ng），上、下游引物各2μL，2×PfuMasterMix50μL，用ddH2O補充到總體積為100μL。PCR反應條件：94℃預變性4min后，分別于94℃變性30s，58℃退火30s和72℃1.3.3表達載體pPICzαA-rnl的構建pPICzαA質粒和目的基因PCR產物都用EcoRI和XbaI進行雙酶切，切膠純化后，用T4DNA連接酶16℃過夜連接酶切產物，然后用CaCl2轉化法轉入E.coliTop10，在含251.4轉化畢赤酵母以及高酶活轉化子的篩選1.4.1重組畢赤酵母的構建重組質粒用限制性內切酶SacI進行線性化后，使用電轉化法轉化到畢赤酵母X-33，取轉化產物涂布于含有100μg/mL的ZeocinYPD平板上，30℃1.4.2高酶活轉化子的篩選將YPDZ平板上的酵母轉化子，分別挑入每個孔含有1mLBMGY的24孔板中，過夜培養(yǎng)，離心倒掉上清，每個孔中加入1mLBMMY培養(yǎng)基，誘導培養(yǎng)24h后，離心，取上清。分別取10μL上清酶液加入已打好孔的羅丹明B篩選平板。35℃1.5重組酵母工程菌的搖瓶培養(yǎng)、酶活測定、酶蛋白的純化和SDS電泳分析1.5.1重組酵母菌搖瓶培養(yǎng)及酶活測定將篩選出的高酶活轉化子，接種于含有50mLBMGY培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃，250r/min振蕩過夜培養(yǎng)至OD600達到2~6。離心收集菌體，再將其重懸浮于BMMY培養(yǎng)基中，稀釋至OD600為1.0，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔24h向BMMY培養(yǎng)基中補加甲醇至終濃度為0.75%進行誘導表達，同時測定重組菌的菌體濃度和脂肪酶酶活。脂肪酶活性測定參照報道的方法進行[15]1.5.2RNL重組蛋白的純化和SDS電泳RNL重組蛋白的純化參照報道的方法進行[16]。將發(fā)酵液離心取上清，上清即為粗酶液；將粗酶液進行超濾濃縮，超濾膜的截流分子量為10kDa；將超濾后的酶液進行SP-sepharoseFastFlow離子交換層析，收集有酶活力的洗脫峰，經透析濃縮后作為SDS上樣液。電泳采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，電壓控制在40V。電泳結束后進行考馬斯亮藍染色。1.6重組RNL的酶學性質1.6.1最適pH及pH穩(wěn)定性在35℃、不同pH（6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10）條件下測定重組RNL的活性，以活性最高時pH值下的酶活為100%，計算其它pH值條件下的相對酶活。將重組RNL分別在pH3-11（緩沖液體系分別為：pH3-7為100mM的檸檬酸-磷酸鈉緩沖液；pH8-9為100mM的Tris-HCL緩沖液；pH10-11為100mM的NaHCO3緩沖液），25℃1.6.2最適反應溫度及耐溫性在pH8.5條件下測定重組RNL在25-50℃不同溫度下的酶活，以測定酶活最高時溫度下的酶活為100%，計算其它溫度下的相對酶活。將重組RNL在不同溫度下(30-701.6.3金屬離子及表面活性劑對重組RNL活性的影響在含有1mmol/L不同金屬離子以及1%不同表面活性劑的環(huán)境中，將重組RNL在25℃1.6.4重組RNL底物特異性在pH8.5，35℃條件下分別測定重組RNL對不同碳鏈長度的脂肪酸甘油酯以及不同脂肪酸2結果和分析2.1表達載體pPICzαA-rnl的構建以提取的雪白根霉基因組DNA為模板，用設計好的引物進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳可見PCR產物大小約為1200bp（圖1）。將該目的片段回收并克隆到表達載體pPICzαA，提取重組質粒，用限制性內切酶EcoRI和XbaI進行雙酶切鑒定，電泳結果顯示片段大小正確（圖1），測序結果表明RNL基因全長為1179bp，起始和終止密碼子分別為ATG和TAA，以上實驗結果表明：表達載體pPICzαA-rnl構建成功。M：DNAmarker;1：脂肪酶基因PCR擴增產物；2：重組質粒pPICzαA-rnl的酶切鑒定圖1脂肪酶基因PCR擴增及重組質粒酶切鑒定Fig.1ElectrophoretogromofPCRandrestrictionenzymeanalysisofplasmidpPICzαA-rnl2.2重組畢赤酵母的構建以及高酶活轉化子的篩選表達載體pPICzαA-rnl經SacI線性化后，電轉入畢赤酵母X-33，涂布在Zeocin抗性平板上，30℃，培養(yǎng)3-4天后長出數(shù)百個轉化子（圖2A）。按照方法1.4.2挑取96個轉化子進行培養(yǎng)，通過羅丹明B平板進行篩選，由圖2B可以看出不同轉化子的上清酶液所產生的熒光圈的大小不同，根據熒光圈的大小選擇R1，R2和R3這三圖2酵母擬轉化子（A）及羅丹明B平板篩選（B）Fig.2Putativetransformants(A)andscreeningoftransformantsbyrhodamineBmediumplates(B)2.3重組轉化子脂肪酶基因的誘導表達及酶活測定將篩選出的高酶活轉化子R1，R2和R3，按照方法1.5.1進行誘導培養(yǎng)，每隔24h取樣測量菌體濃度和上清發(fā)酵液的酶活。經過比較分析，轉化子R3的重組酶活最高，其發(fā)酵曲線如圖3所示：誘導到144h時，菌體濃度和酶活均達到最大值，其中菌體的OD值為44，酶活為48U/mL。圖3重組畢赤酵母產酶曲線和生長曲線Fig.3Cellgrowthandlipaseproductionofrecombinantyeast2.4SDS分析將純化后的重組RNL進行SDS-PAGE分析。由圖4可知，重組酶分子質量約32kD，這與經ExPASyProteomicsServer軟件對重組RNL的氨基酸序列進行分子質量預測值接近。M：蛋白Marker；1：超濾后的重組RNL；2：經SP-sepharoseFastFlow離子交換層析后的重組RNL圖4重組RNL的SDS分析Fig.4SDSanalysisoftherecombinantlipase2.5重組RNL的酶學性質2.5.1重組RNL的最適pH及pH穩(wěn)定性在35℃，不同pH條件下測定重組RNL的酶活，實驗結果見圖5A。從圖5A可以看出在pH6-8.5范圍內，隨著pH值的升高酶活也逐漸升高，在pH8.5-10范圍內重組RNL的活性逐漸下降，說明重組RNL的最適pH值為8.5。將重組RNL在不同pH條件下室溫保存24圖5重組脂肪酶的最適反應pH值（A）及pH穩(wěn)定性(B)Fig.5EffectofpHonactivityandstabilityoftherecombinantlipase2.5.2重組RNL的最適反應溫度及熱穩(wěn)定性在pH8.5條件下，分別在不同溫度下測定重組RNL的酶活，實驗結果見圖6。由圖6可知：在30-35℃范圍內重組RNL的酶活逐漸上升，在35-70℃范圍內重組RNL的酶活逐漸下降，說明重組RNL的最適反應溫度為35℃。耐溫性方面：將重組RNL分別在30-70℃水浴保溫10min，再在最適反應條件下測定剩余酶活。實驗結果表明：在30-50℃范圍內，重組RNL具有較好的穩(wěn)定性，剩余酶活可達到75%以上；當溫度超過55圖6重組脂肪酶最適反應溫度及熱穩(wěn)定性Fig.6Effectoftemperatureonactivityandstabilityoftherecombinantlipase2.5.3金屬離子及表面活性劑對重組RNL活性的影響金屬離子對重組RNL活性的影響見表1。由表1可知，1mmol/L的Mn2+、Ca2+和K+對重組RNL具有激活作用，相比對照分別提高8%、8%和25%。除了Mg2+其他金屬離子對重組RNL活性的影響較小，剩余酶活都在83%-100%之間。表2結果顯示：1%含量的吐溫80、吐溫20以及曲通100對重組RNL具有激活作用，活性分別提高52%、36%和26%。SDS對重組RNL具有較強的抑制作用，當SDS含量為1%的情況下重組RNL的酶活減少到只有對照的30%。表1不同金屬離子對重組脂肪酶活性的影響Table1Effectofdifferentmetalionsonactivityoftherecombinantlipase金屬離子對照Mn2+Li+Co2+Cu2+Ca2+Mg2+K+Na+Zn2+Fe3+相對酶活（%）1001088310092108561259210092表2表面活性劑對重組脂肪酶活性的影響Table2Effectofdifferentchemicalsonactivityoftherecombinantlipase表面活性試劑對照SDS吐溫80吐溫20曲通100相對酶活（%）100401521361262.5.4重組脂肪酶的底物特異性重組RNL對不同底物的活性見表3，由表3可知重組RNL對長碳鏈底物的活性高于短碳鏈的底物。脂肪酸甘油酯方面，重組RNL的最適底物為三月桂酸甘油酯（C12），其次對三棕櫚酸甘油酯（C16）的活性較高；脂肪酸甲酯方面，重組RNL對月桂酸甲酯（C12）的活性最高，其次是棕櫚酸甲酯（C16）。表3重組脂肪酶的底物特異性Table2Substratespecificityoftherecombinantlipase底物相對酶活（%）三丁酸甘油酯（C4）36三辛酸甘油酯（C8）45三月桂酸甘油酯（C12）100三棕櫚酸甘油酯（C16）65三硬脂酸甘油酯（C18）55丁酸甲酯（C4）6辛酸甲酯（C8）11月桂酸甲酯（C12）25棕櫚酸甲酯（C16）15硬脂酸甲酯（C18）153結論本文從雪白根霉中克隆得到一個脂肪酶基因，并將該基因和酵母表達載體pPICzαA連接，構建了酵母表達質粒pPICzαA-rnl。將重組質粒轉化至畢赤酵母X-33，經過YPDZ、羅丹明B平板篩選和搖瓶篩選，最終得到一株高表達重組RNL的酵母工程菌，該重組酵母工程菌在搖瓶培養(yǎng)條件下酶活最高可達48U/mL。通過超濾以及SP-sepharoseFastFlow離子交換層析從發(fā)酵液中得到純化的重組RNL。酶學性質研究表明：重組RNL的最適反應pH值和溫度分別為8.5和35℃并且在pH5-10以及30-50℃范圍內具有較好的穩(wěn)定性；1mmol/L的金屬離子Mn2+、Ca2+和K+對重組RNL具有激活作用，而Mg2+對重組RNL具有一定的抑制作用；1%的表面活性劑吐溫80、吐溫20以及曲通100均對重組RNL具有激活作用，比對照分別提高52%、36%和26%；重組RNL在底物特異性方面偏愛于長碳鏈的底物參考文獻[1]JaegerKE,EggertT.Lipases

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