雪白根霉脂肪酶基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究

PAGE——————珠海市科技攻關(guān)及高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化（2012D0201990042）雪白根霉脂肪酶基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究王建榮，劉丹妮，李鵬，劉金山，周平發(fā)，陳麗芝，聶金梅，鐘開興，李陽源*（廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東珠海，519060）摘要：采用同源克隆法獲得了雪白根霉的脂肪酶基因（rnl），將其連接到pPICZαA載體上，得到重組表達(dá)載體pPICZαA-rnl。將表達(dá)載體pPICZαA-rnl用限制性內(nèi)切酶SacI線性化后，電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33中。雪白根霉脂肪酶基因在畢赤酵母X-33中成功表達(dá)，重組菌株搖瓶培養(yǎng)144h后，酶活可達(dá)48U/mL。重組酶最適pH值為8.5，最適反應(yīng)溫度為35℃。1mmol/L的Mn2+,Ca2+和K+以及1%的表面活性劑吐溫20，吐溫80，曲通100對重組脂肪酶具有激活作用。重組酶的最適底物為三月桂酸甘油酯（C12）關(guān)鍵詞：雪白根霉，脂肪酶，畢赤酵母X-33脂肪酶（Lipase，E.C.），全稱為三?；视王Ｋ饷福╰riacylglycerolacylhydrolase），它屬于α/β折疊酶家族，是一種絲氨酸水解酶。脂肪酶可以在油水界面上催化天然底物油脂水解,釋放更少酯鍵的甘油酯或甘油及脂肪酸，而在非水相體系中脂肪酶還可催化轉(zhuǎn)酯和酯合成等多種反應(yīng)[1]。脂肪酶作為一種重要的工業(yè)酶被廣泛的應(yīng)用到食品加工、洗滌、醫(yī)藥等領(lǐng)域。脂肪酶廣泛的存在于動植物和微生物中，相對于動植物，微生物分泌的脂肪酶具有很多的優(yōu)勢：如微生物分泌的脂肪酶一般都為胞外酶，更適合工業(yè)化大生產(chǎn)；微生物來源的脂肪酶具有更廣的作用溫度范圍、作用pH以及底物專一性[2-3]。隨著國內(nèi)外對脂肪酶研究的深入，越來越多的微生物脂肪酶被發(fā)掘出來。微生物脂肪酶主要分為細(xì)菌脂肪酶和真菌脂肪酶兩大類，細(xì)菌脂肪酶研究較多的是假單胞菌屬脂肪酶[4]，真菌脂肪酶的研究主要集中在根霉屬和酵母屬兩大類[5-6]。相對于其他微生物來源的脂肪酶，根霉屬脂肪酶具有高度的1、3位置專一性和立體選擇性。在根霉脂肪酶中，來源于米根霉的脂肪酶被廣泛應(yīng)用于生物柴油的生產(chǎn)[7-8]；來源于華根霉的脂肪酶主要應(yīng)用于烘焙食品、有機(jī)合成等領(lǐng)域[9-10]；相對于以上兩種根霉脂肪酶，雪白根霉脂肪酶主要應(yīng)用于油脂加工、改性等領(lǐng)域[11-12]。為了進(jìn)一步提高雪白根霉脂肪酶（RNL）的酶活及改善其酶學(xué)性質(zhì)，許多學(xué)者開始應(yīng)用分子生物學(xué)的方法研究其脂肪酶基因的克隆、表達(dá)、調(diào)控等。迄今，雪白根霉脂肪酶基因已經(jīng)在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)[13]。相對于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有更多的優(yōu)勢：培養(yǎng)條件簡單、易于操作便于工業(yè)化生產(chǎn)；高穩(wěn)定性表達(dá)，可高效的表達(dá)外源蛋白等[14]。到目前為止，還沒有關(guān)于雪白根霉脂肪酶基因在畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)的研究報道。本研究首次將雪白根霉脂肪酶基因在畢赤酵母中進(jìn)行了異源表達(dá)并且測定了重組雪白根霉脂肪酶（RNL）的酶學(xué)性質(zhì)，為下一步對雪白根霉脂肪酶基因進(jìn)行基因改造以及高密度發(fā)酵重組雪白根霉脂肪酶酵母工程菌奠定基礎(chǔ)。1.材料與方法1.1材料與試劑表達(dá)載體pPICZαA、畢赤酵母X-33，博萊霉素，購自美國Invitrogen公司。大腸桿菌Top10，高保真Pfu酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRI、XbaI、質(zhì)粒提取試劑盒、真菌基因組提取試劑盒、PCR純化試劑，購自上海生工公司；不同碳鏈長度的脂肪酶底物，購自美國Sigma公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純或進(jìn)口分裝；引物由深圳華大基因合成。大腸桿菌用LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，酵母轉(zhuǎn)化子分別用YPDZ和羅丹明B培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，酵母搖瓶培養(yǎng)及產(chǎn)酶培養(yǎng)基分別為BMGY和BMMY。LB、YPDZ、BMGY和BMMY培養(yǎng)基分別參照Invitrogen公司的酵母表達(dá)手冊進(jìn)行配置。羅丹明B培養(yǎng)基的配方為：在YPD培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入2×10-4%（w/v）的羅丹明B和1%（v/v）的橄欖油。1.2儀器與設(shè)備PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、冷凍離心機(jī)，珠海黑馬科技有限公司；電穿孔儀，美國Bio-Rad公司；脂肪酶活性測定酸堿滴定儀，瑞士Metrohm公司；1.3雪白根霉脂肪酶基因克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建1.3.1雪白根霉基因組DNA的提取挑取雪白根霉菌絲體，接入50mLPDA液體培養(yǎng)基中，30℃，200r/min培養(yǎng)3天，離心取菌體，參照真菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。用微量紫外分光光度計測定DNA的濃度，選取A260/A280值在1.8~2.0的樣品于-201.3.2雪白根霉脂肪酶基因克隆據(jù)文獻(xiàn)報道[13]，雪白根霉的脂肪酶基因不含有內(nèi)含子，因此可以以雪白根霉的基因組DNA為模板，通過PCR的方法擴(kuò)增rnl。經(jīng)過分析NCBI上已報道的rnl的全基因組DNA序列（Genebank登錄號為：AB013496），設(shè)計了一對引物，上游引物：5'-CAGCGAATTCATGGTTTCATTCATTTCCATT-3'和下游引物：5'-GACGTCTAGATTACAAACAGCTTCCTTCGTT-3'（分別含有EcoRI和XbaI酶切位點(diǎn)）。以提取的雪白根霉基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：DNA模板1μL（約50ng），上、下游引物各2μL，2×PfuMasterMix50μL，用ddH2O補(bǔ)充到總體積為100μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min后，分別于94℃變性30s，58℃退火30s和72℃1.3.3表達(dá)載體pPICzαA-rnl的構(gòu)建pPICzαA質(zhì)粒和目的基因PCR產(chǎn)物都用EcoRI和XbaI進(jìn)行雙酶切，切膠純化后，用T4DNA連接酶16℃過夜連接酶切產(chǎn)物，然后用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E.coliTop10，在含251.4轉(zhuǎn)化畢赤酵母以及高酶活轉(zhuǎn)化子的篩選1.4.1重組畢赤酵母的構(gòu)建重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SacI進(jìn)行線性化后，使用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到畢赤酵母X-33，取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有100μg/mL的ZeocinYPD平板上，30℃1.4.2高酶活轉(zhuǎn)化子的篩選將YPDZ平板上的酵母轉(zhuǎn)化子，分別挑入每個孔含有1mLBMGY的24孔板中，過夜培養(yǎng)，離心倒掉上清，每個孔中加入1mLBMMY培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后，離心，取上清。分別取10μL上清酶液加入已打好孔的羅丹明B篩選平板。35℃1.5重組酵母工程菌的搖瓶培養(yǎng)、酶活測定、酶蛋白的純化和SDS電泳分析1.5.1重組酵母菌搖瓶培養(yǎng)及酶活測定將篩選出的高酶活轉(zhuǎn)化子，接種于含有50mLBMGY培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃，250r/min振蕩過夜培養(yǎng)至OD600達(dá)到2~6。離心收集菌體，再將其重懸浮于BMMY培養(yǎng)基中，稀釋至OD600為1.0，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔24h向BMMY培養(yǎng)基中補(bǔ)加甲醇至終濃度為0.75%進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時測定重組菌的菌體濃度和脂肪酶酶活。脂肪酶活性測定參照報道的方法進(jìn)行[15]1.5.2RNL重組蛋白的純化和SDS電泳RNL重組蛋白的純化參照報道的方法進(jìn)行[16]。將發(fā)酵液離心取上清，上清即為粗酶液；將粗酶液進(jìn)行超濾濃縮，超濾膜的截流分子量為10kDa；將超濾后的酶液進(jìn)行SP-sepharoseFastFlow離子交換層析，收集有酶活力的洗脫峰，經(jīng)透析濃縮后作為SDS上樣液。電泳采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，電壓控制在40V。電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。1.6重組RNL的酶學(xué)性質(zhì)1.6.1最適pH及pH穩(wěn)定性在35℃、不同pH（6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10）條件下測定重組RNL的活性，以活性最高時pH值下的酶活為100%，計算其它pH值條件下的相對酶活。將重組RNL分別在pH3-11（緩沖液體系分別為：pH3-7為100mM的檸檬酸-磷酸鈉緩沖液；pH8-9為100mM的Tris-HCL緩沖液；pH10-11為100mM的NaHCO3緩沖液），25℃1.6.2最適反應(yīng)溫度及耐溫性在pH8.5條件下測定重組RNL在25-50℃不同溫度下的酶活，以測定酶活最高時溫度下的酶活為100%，計算其它溫度下的相對酶活。將重組RNL在不同溫度下(30-701.6.3金屬離子及表面活性劑對重組RNL活性的影響在含有1mmol/L不同金屬離子以及1%不同表面活性劑的環(huán)境中，將重組RNL在25℃1.6.4重組RNL底物特異性在pH8.5，35℃條件下分別測定重組RNL對不同碳鏈長度的脂肪酸甘油酯以及不同脂肪酸2結(jié)果和分析2.1表達(dá)載體pPICzαA-rnl的構(gòu)建以提取的雪白根霉基因組DNA為模板，用設(shè)計好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見PCR產(chǎn)物大小約為1200bp（圖1）。將該目的片段回收并克隆到表達(dá)載體pPICzαA，提取重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI進(jìn)行雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示片段大小正確（圖1），測序結(jié)果表明RNL基因全長為1179bp，起始和終止密碼子分別為ATG和TAA，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：表達(dá)載體pPICzαA-rnl構(gòu)建成功。M：DNAmarker;1：脂肪酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2：重組質(zhì)粒pPICzαA-rnl的酶切鑒定圖1脂肪酶基因PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.1ElectrophoretogromofPCRandrestrictionenzymeanalysisofplasmidpPICzαA-rnl2.2重組畢赤酵母的構(gòu)建以及高酶活轉(zhuǎn)化子的篩選表達(dá)載體pPICzαA-rnl經(jīng)SacI線性化后，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33，涂布在Zeocin抗性平板上，30℃，培養(yǎng)3-4天后長出數(shù)百個轉(zhuǎn)化子（圖2A）。按照方法1.4.2挑取96個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)，通過羅丹明B平板進(jìn)行篩選，由圖2B可以看出不同轉(zhuǎn)化子的上清酶液所產(chǎn)生的熒光圈的大小不同，根據(jù)熒光圈的大小選擇R1，R2和R3這三圖2酵母擬轉(zhuǎn)化子（A）及羅丹明B平板篩選（B）Fig.2Putativetransformants(A)andscreeningoftransformantsbyrhodamineBmediumplates(B)2.3重組轉(zhuǎn)化子脂肪酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活測定將篩選出的高酶活轉(zhuǎn)化子R1，R2和R3，按照方法1.5.1進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔24h取樣測量菌體濃度和上清發(fā)酵液的酶活。經(jīng)過比較分析，轉(zhuǎn)化子R3的重組酶活最高，其發(fā)酵曲線如圖3所示：誘導(dǎo)到144h時，菌體濃度和酶活均達(dá)到最大值，其中菌體的OD值為44，酶活為48U/mL。圖3重組畢赤酵母產(chǎn)酶曲線和生長曲線Fig.3Cellgrowthandlipaseproductionofrecombinantyeast2.4SDS分析將純化后的重組RNL進(jìn)行SDS-PAGE分析。由圖4可知，重組酶分子質(zhì)量約32kD，這與經(jīng)ExPASyProteomicsServer軟件對重組RNL的氨基酸序列進(jìn)行分子質(zhì)量預(yù)測值接近。M：蛋白Marker；1：超濾后的重組RNL；2：經(jīng)SP-sepharoseFastFlow離子交換層析后的重組RNL圖4重組RNL的SDS分析Fig.4SDSanalysisoftherecombinantlipase2.5重組RNL的酶學(xué)性質(zhì)2.5.1重組RNL的最適pH及pH穩(wěn)定性在35℃，不同pH條件下測定重組RNL的酶活，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5A。從圖5A可以看出在pH6-8.5范圍內(nèi)，隨著pH值的升高酶活也逐漸升高，在pH8.5-10范圍內(nèi)重組RNL的活性逐漸下降，說明重組RNL的最適pH值為8.5。將重組RNL在不同pH條件下室溫保存24圖5重組脂肪酶的最適反應(yīng)pH值（A）及pH穩(wěn)定性(B)Fig.5EffectofpHonactivityandstabilityoftherecombinantlipase2.5.2重組RNL的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性在pH8.5條件下，分別在不同溫度下測定重組RNL的酶活，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。由圖6可知：在30-35℃范圍內(nèi)重組RNL的酶活逐漸上升，在35-70℃范圍內(nèi)重組RNL的酶活逐漸下降，說明重組RNL的最適反應(yīng)溫度為35℃。耐溫性方面：將重組RNL分別在30-70℃水浴保溫10min，再在最適反應(yīng)條件下測定剩余酶活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在30-50℃范圍內(nèi)，重組RNL具有較好的穩(wěn)定性，剩余酶活可達(dá)到75%以上；當(dāng)溫度超過55圖6重組脂肪酶最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性Fig.6Effectoftemperatureonactivityandstabilityoftherecombinantlipase2.5.3金屬離子及表面活性劑對重組RNL活性的影響金屬離子對重組RNL活性的影響見表1。由表1可知，1mmol/L的Mn2+、Ca2+和K+對重組RNL具有激活作用，相比對照分別提高8%、8%和25%。除了Mg2+其他金屬離子對重組RNL活性的影響較小，剩余酶活都在83%-100%之間。表2結(jié)果顯示：1%含量的吐溫80、吐溫20以及曲通100對重組RNL具有激活作用，活性分別提高52%、36%和26%。SDS對重組RNL具有較強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)SDS含量為1%的情況下重組RNL的酶活減少到只有對照的30%。表1不同金屬離子對重組脂肪酶活性的影響Table1Effectofdifferentmetalionsonactivityoftherecombinantlipase金屬離子對照Mn2+Li+Co2+Cu2+Ca2+Mg2+K+Na+Zn2+Fe3+相對酶活（%）1001088310092108561259210092表2表面活性劑對重組脂肪酶活性的影響Table2Effectofdifferentchemicalsonactivityoftherecombinantlipase表面活性試劑對照SDS吐溫80吐溫20曲通100相對酶活（%）100401521361262.5.4重組脂肪酶的底物特異性重組RNL對不同底物的活性見表3，由表3可知重組RNL對長碳鏈底物的活性高于短碳鏈的底物。脂肪酸甘油酯方面，重組RNL的最適底物為三月桂酸甘油酯（C12），其次對三棕櫚酸甘油酯（C16）的活性較高；脂肪酸甲酯方面，重組RNL對月桂酸甲酯（C12）的活性最高，其次是棕櫚酸甲酯（C16）。表3重組脂肪酶的底物特異性Table2Substratespecificityoftherecombinantlipase底物相對酶活（%）三丁酸甘油酯（C4）36三辛酸甘油酯（C8）45三月桂酸甘油酯（C12）100三棕櫚酸甘油酯（C16）65三硬脂酸甘油酯（C18）55丁酸甲酯（C4）6辛酸甲酯（C8）11月桂酸甲酯（C12）25棕櫚酸甲酯（C16）15硬脂酸甲酯（C18）153結(jié)論本文從雪白根霉中克隆得到一個脂肪酶基因，并將該基因和酵母表達(dá)載體pPICzαA連接，構(gòu)建了酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICzαA-rnl。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33，經(jīng)過YPDZ、羅丹明B平板篩選和搖瓶篩選，最終得到一株高表達(dá)重組RNL的酵母工程菌，該重組酵母工程菌在搖瓶培養(yǎng)條件下酶活最高可達(dá)48U/mL。通過超濾以及SP-sepharoseFastFlow離子交換層析從發(fā)酵液中得到純化的重組RNL。酶學(xué)性質(zhì)研究表明：重組RNL的最適反應(yīng)pH值和溫度分別為8.5和35℃并且在pH5-10以及30-50℃范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性；1mmol/L的金屬離子Mn2+、Ca2+和K+對重組RNL具有激活作用，而Mg2+對重組RNL具有一定的抑制作用；1%的表面活性劑吐溫80、吐溫20以及曲通100均對重組RNL具有激活作用，比對照分別提高52%、36%和26%；重組RNL在底物特異性方面偏愛于長碳鏈的底物參考文獻(xiàn)[1]JaegerKE,EggertT.Lipases

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