專業(yè)技術(shù)知識01-色譜柱的分類、維護及管理

液相色譜柱的分類、維護與管理研發(fā)項目經(jīng)理李蒲江色譜柱的分離原理色譜柱的分類色譜柱的常見異?，F(xiàn)象0102目錄CONTENTS030405色譜柱修護與再生色譜柱的管理Part1色譜柱的分離原理目錄CONTENTS石油醚碳酸鈣顆粒色素色譜組分1906年俄國植物學(xué)家Tsweet發(fā)現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象色譜的起源Part1

色譜柱的分離原理1Basicprincipleofchromatographicseparation1.1色譜分離基本原理PartitioncoefficientK分配系數(shù)Part1

色譜柱的分離原理6高效液相色譜儀的分析原理高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)色譜柱在高效液相色譜儀中的作用和峰形產(chǎn)生原理高壓泵進樣器檢測器色譜工作站色譜柱Part1

色譜柱的分離原理硅膠顆粒基質(zhì)合成步驟：1.合成硅膠基質(zhì)2.鍵合配體(鍵合相)3.端基封尾end-cappedPart1

色譜柱的分離原理Part2色譜柱的分類目錄CONTENTS色譜柱的分類Part2

色譜柱的分類色譜柱有多種不同的分類方法根據(jù)固定相極性的不同可分為極性色譜柱和非極性色譜柱;根據(jù)固定相和流動相的相對極性的不同可分為正相色譜柱和反相色譜柱根據(jù)色譜柱填充劑的差別可分為硅膠柱、化學(xué)鍵合硅膠柱、離子交換樹脂柱、凝膠柱、玻璃微球柱等。在化學(xué)鍵合硅膠柱中以十八烷基鍵合硅膠柱應(yīng)用最廣泛，辛基硅烷鍵合硅膠柱次之，即通常所說的C18和C8柱，胺基柱、腈基柱和苯基柱也偶有使用。根據(jù)色譜柱內(nèi)徑的不同，液相色譜柱可分為微徑柱、分析柱、快速柱、半制備柱、制備柱等，適用于不同的分離分析目的。常用的普通分析柱，內(nèi)徑通常為4.6mm(3/16in)，柱長15?25cm，填料粒徑5?10pm，用于常規(guī)的分離分析。快速分析柱的內(nèi)徑一般為6mm或更大，柱長30~80mm，填料粒徑為3pm或更小。半制備柱與制備柱，內(nèi)徑一般在6mm以上，用于半制備或制備目的。而微徑柱內(nèi)徑一般為1mm，甚至有更小內(nèi)徑的毛細(xì)管柱，與常規(guī)分析柱相比，需要特殊的裝填技術(shù)，并配合高精度的微流泵(nanopump)使用。01按固定相化學(xué)性質(zhì)分類Part2

色譜柱的分類02色譜柱類型分離原理適用對象填料反相色譜柱用鍵合非極性基團的載體填充而成的色譜柱,根據(jù)物質(zhì)極性差異進行分離.固定相的極性小于流動相的極性適用于大多數(shù)化合物,如蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、核酸、甾體、脂類、脂肪酸、糖類、生物堿等含有非極性基團的化合物十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、辛烷基硅烷鍵合硅膠(C8)、苯基鍵合硅膠、硅膠等.正相色譜柱用硅膠或鍵合極性基團的硅膠填充而成的色譜柱,根據(jù)物質(zhì)極性差異進行分離.固定相的極性大于流動相的極性.(也可使用含水流動相，HILIC)適用于非極性至中等極性的中小分子化合物的分離，如脂溶性維生素、甾體激素等硅膠、氨基鍵合硅膠、氰基鍵合硅膠等離子交換色譜柱以離子交換樹脂或化學(xué)鍵合離子交換劑為固定相,利用被分離組分離子交換能力的差別或選擇系數(shù)的差別而實現(xiàn)分離。適用于離子或可離解的化合物,如無機離子、有機酸、核苷酸、氨基酸、抗生素、蛋白質(zhì)等.有機共聚物樹脂、硅膠微球離子交換劑、螯合樹脂等.分子排阻色譜柱根據(jù)凝膠孔隙的孔徑大小與高分子樣品分子的線團尺寸間的相對關(guān)系，對溶質(zhì)進行分離，大分子的物質(zhì)保留弱用于分析多肽、蛋白質(zhì)、核酸、多糖、聚乙烯、聚氯乙烯等葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、苯乙烯Ｇ二乙烯基苯共聚物、高交聯(lián)度苯乙烯Ｇ二乙烯基苯共聚物手性拆分色譜柱由具有光學(xué)活性的單體,固定在硅膠或其他聚合物上制成手性固定相,通過引入手性環(huán)境使對映異構(gòu)體間呈現(xiàn)物理特征的差異,從而實現(xiàn)光學(xué)異構(gòu)體的拆分光學(xué)異構(gòu)體纖維素、環(huán)糊精、大環(huán)抗生素、蛋白質(zhì)等按USP編號分類Part2

色譜柱的分類03USP編號填料說明簡稱L13～10μm十八烷基鍵合多孔硅膠或無機氧化物微粒固定相ODS柱L230～50μm表面多孔薄殼型鍵合十八烷基固定相C18柱L3多孔硅膠微粒，即一般的硅膠柱

L430～50μm表面多孔薄殼型硅膠柱

L530～50μm表面多孔薄殼型氧化鋁柱

L630～50μm實心微球表面包覆磺化碳氟聚合物，強陽離子交換柱

L7全多孔硅膠微粒鍵合C8官能團固定相C8柱L8全多孔硅膠微粒鍵合非交聯(lián)NH2固定相

3to10μmNH2柱L9強酸性陽離子交換基團鍵合全多孔不規(guī)則形硅膠固定相SCX柱L10多孔硅膠微球鍵合氰基固定相（CN）CN柱L11鍵合苯基多孔硅膠微球固定相苯基柱L12無孔微球鍵合季胺功能團的強陰離子交換柱

L13三乙基硅烷化學(xué)鍵合全多孔硅膠微球固定相（C1）C1柱L1410μm硅膠化學(xué)鍵合強堿性季銨鹽陰離子交換固定相SAX柱L15已基硅烷化學(xué)鍵合全多孔硅膠微球固定相C6柱按USP編號分類Part2

色譜柱的分類03USP編號填料說明簡稱L16二甲基硅烷化學(xué)鍵合全多孔硅膠微粒固定相C2柱L17氫型磺化交聯(lián)苯乙烯-二乙烯基苯共聚物,強陽離子交換柱L183～10μm全多孔硅膠化學(xué)鍵合胺基（NH2）和氰基（CN）柱

L19鈣型磺化交聯(lián)苯乙烯－二乙烯基苯共聚物，強陽離子交換柱

L20二羥基丙烷基化學(xué)鍵合多孔硅膠微球固定相（Diol）二醇基柱L21剛性苯乙烯－二乙烯基苯共聚物微球填料柱

L22帶有磺酸基團的多孔苯乙烯陽離子交換柱

L23帶有季胺基團的聚甲基丙烯酸甲酯或聚丙烯酸酯多孔離子交換柱

L24表面含有大量羥基的半剛性聚乙烯醇親水凝膠柱

L25聚甲基丙烯酸酯樹脂交聯(lián)羥基醚（表面含有殘余羧基功能團）樹脂。能分離分子量100～5000范圍的水溶性中性、陽離子型及陰離子型聚合物（用聚氧乙烯測定）的固定相

L26丁基硅烷化學(xué)鍵合全多孔硅膠微球固定相2.1×100mm,5μmL2730～50μm的全多孔硅膠微粒

L28多功能載體，100?的高純硅膠加以氨基鍵合以及C8反相鍵合的官能團

L29氧化鋁,反相鍵合,含碳量低,氧化鋁基聚丁二稀小球，5μm，孔徑80?

L30全多孔硅膠鍵合乙基硅烷固定相

按USP編號分類Part2

色譜柱的分類03USP編號填料說明簡稱L31季胺基改性孔徑2000?的交聯(lián)苯乙烯和二乙烯基苯(55%)強陰離子交換樹脂

L32L-脯氨酸銅配合物共價鍵合于不規(guī)則形硅膠微粒的配位體的交換手性色譜填料

L33能夠分離分子量4000～40000范圍蛋白質(zhì)分子的球形硅膠固定相,pH穩(wěn)定性好

L34鉛型磺化交聯(lián)苯乙烯－二乙烯基苯共聚物強陽離子交換樹脂，9mm球形

L35鋯穩(wěn)定的硅膠微球鍵合二醇基親水分子單層固定相，孔徑150?

L365mm胺丙基硅膠鍵合L-苯基氨基乙酸－3,5二硝基苯甲酰

L37適合分離分子量2000～40000的聚甲基丙烯酸酯凝膠

L38水溶性甲基丙烯酸酯基質(zhì)SEC色譜柱

L39親水全多孔聚羥基甲基丙烯酸酯色譜柱

L40Tris3,5－二甲基苯基氨基甲酸酯纖維素涂覆多孔硅膠微球

L41球形硅膠表面固定α1酸糖蛋白固定相

L42C8和C18硅烷化學(xué)鍵合多孔硅膠固定相

L43硅膠微球鍵合五氟代苯基固定相VertexPFPL44多功能固定相,60?高純硅膠基質(zhì)鍵合磺酸陽離子交換功能團和C8反相功能團

L45β-環(huán)糊精鍵合多孔硅膠微球

L46季胺基改性苯乙烯-二乙烯基苯聚合物微球

Part3色譜柱的修護與再生目錄CONTENTSPart3

色譜柱的修護與再生01色譜柱的修護1.污染的修復(fù)在ODS柱再生無效或已知污染嚴(yán)重時，可以采用柱修補的方法解決。只要污染深度不超過5mm左右都可以。方法是將污染部分用特制小鏟小心挖去。用柱子相同的固定相加流動相制成漿狀，用特制小鏟把制成漿狀固定相仔細(xì)補人挖去部分(盡量使后填補的固定相接近原裝的緊密程度)，修平端面即告完成。修好的柱子要顛倒使用一段時間，目的是借助流動相沖洗作用，恢復(fù)床層緊密程度。Part3

色譜柱的修護與再生01色譜柱的修護2.1色譜柱非疏水塌陷的修護

塌陷的原因很多。對于不太嚴(yán)重時，可將柱顛倒使用，即可恢復(fù)性能，每顛倒一次約維持1～2天。當(dāng)塌陷嚴(yán)重(5mm左右)，可采用污染的恢復(fù)方法，將固定相填補人塌陷部分2.2色譜柱疏水塌陷的修護①70%甲醇等度沖洗12h以上

②10%甲醇等度沖洗12h以上③梯度修護流動相時間甲醇水0-360min7030360-420min1090420-780min1090Part3

色譜柱的修護與再生02色譜柱的再生反向色譜柱再生：①甲醇-水（95:5）甲醇二氯甲烷

②二氯甲烷甲醇甲醇-水（95:5）

③每個流動相需沖洗20-30倍柱體積正相色譜柱再生：①正己烷異丙醇二氯甲烷甲醇

②甲醇二氯甲烷異丙醇正己烷③每個流動相需沖洗20-30倍柱體積離子交換柱的再生：①陰離子柱可使用稀酸緩沖液沖洗②陰離子柱可以使用堿緩沖液沖洗Part4色譜柱的常見異?，F(xiàn)象目錄CONTENTS01Part4

色譜柱的常見異?，F(xiàn)象異常現(xiàn)象原因1、壓力為零，不上升或流動相流量為零色譜柱柱前管路接頭處泄露2、有柱前壓，但流量為零（1）柱進口堵塞（2）色譜柱鏈接件漏液3、柱前壓上升，流量下降，甚至到零（1）柱上端不銹鋼多孔濾片被膠片碎沫堵塞，（2）柱下端不銹鋼多孔濾片被填料細(xì)顆粒堵塞（3）柱子阻力增大，由于以水作為流動相的體系，柱子內(nèi)微生物生長而使柱子堵塞4、不能調(diào)零（1）柱子被污染（2）柱填料中有空氣（3）固定相流失過多（4）以前流動相沒有沖凈5、基線噪聲大（1）柱配件或接頭處漏液（2）從柱來的顆粒物質(zhì)通過或進入檢測器（3）柱溫波動大6、基線突然起變化保留強的溶質(zhì)，緩慢地從柱中流出7、基線漂移（1）色譜柱被玷污（2）色譜柱固定相流失（3）柱溫室溫度變化（4）更換流動相后柱子沒有達(dá)到平衡（5）強吸附組分從柱中洗脫出來色譜柱的常見異?，F(xiàn)象與原因01異?，F(xiàn)象原因8、沒有色譜峰出現(xiàn)色譜柱體系有故障9、出現(xiàn)負(fù)峰微量空氣進入柱內(nèi)，并洗脫出來10峰型不好，出現(xiàn)平頭峰或拖尾峰色譜柱超負(fù)荷色譜柱體系不合適柱子填料特性不良柱外效應(yīng)11、峰形展寬（1）色譜柱床層塌陷或失效，使用時間過長，修理次數(shù)過多（2）進樣量超負(fù)荷，引起色譜柱及檢測器出現(xiàn)飽和現(xiàn)象12、峰形前伸（1）色譜柱床層裝填不緊（2）柱子床層斷裂（3）柱端部固定相板結(jié)13、峰形后延柱外效應(yīng)嚴(yán)重，尤其是柱后死區(qū)大14、出現(xiàn)雙峰（1）柱端床層被擾亂（2）經(jīng)過修補的柱子床端面不平整15、異常峰的出現(xiàn)，如裂頭峰或色譜峰嚴(yán)重擴散（1）色譜柱填充不均勻或存在間隙（2）柱頂部塌陷；異?，F(xiàn)象原因16、保留時間變長（1）柱溫過低（2）梯度系統(tǒng)不合適（3）固定相流失色譜柱的常見異常現(xiàn)象與原因Part4

色譜柱的常見異?，F(xiàn)象01異常現(xiàn)象原因17、保留時間減少（1）柱被污染，柱效下降（2）固定相流失（3）梯度系統(tǒng)對色譜柱固定相不合適（4）柱溫過高18、分離度下降（1）柱子超負(fù)荷（2