姜油和6-姜酚對小鼠肝臟ugsul1a1和gs活性及其mrna表達的影響

姜油和6-姜酚對小鼠肝臟ugsul1a1和gs活性及其mrna表達的影響

生姜是姜科植物的新鮮根莖。它不僅是一種很好的味道，而且是一種常見的中藥。6-姜酚是生姜中所含揮發(fā)性物質(zhì)的主要成分,含量占生姜的0.9%~2.8%。文獻報道,其具有止嘔、抑制腫瘤、預(yù)防胃黏膜潰瘍等功效。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(uridine-diphosphateglucuronosyltransferases,UGT)、硫酸轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferase,SULT)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase,GST)是Ⅱ相代謝酶的主要成員。前期研究發(fā)現(xiàn)(內(nèi)部資料),姜油(Gingeroil,GO)及其主要成分6-姜酚(6-gingerol)對Ⅰ相代謝中的CYP3A具有明顯的抑制作用。本實驗對主要的Ⅱ相代謝酶的影響進行研究。材料和方法1-姜油、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶測定動物NIH小鼠(SPF級),體重18~26g,雌雄各半,廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,動物合格證號SCXK(粵2008-0020),粵監(jiān)證號2008A003。藥品與試劑姜油(CO2超臨界提取,含8%的6-姜酚),廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技園提供;6-姜酚,含量:98%,批號:SDF0409,日本和光純藥工業(yè)株式會社生產(chǎn)。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒,南京建成生物工程研究所提供;其他試劑均為分析純。儀器HeaeusBiofugestratos高速冷凍離心機,ThermoElectronCorporation產(chǎn)品;G7-953T組織勻漿機,日本AsOne,HOM產(chǎn)品;實時熒光定量PCR儀,美國AppliedBiosystems產(chǎn)品;核酸蛋白檢測儀,美國BIO-RADLaboratories產(chǎn)品。2實驗方法2.1cmc溶液測定將50只小鼠隨機分為5組。分別為CMC溶媒組(0.5%CMC溶液,10mL·kg-1)、姜油高、中、低劑量組(15.0,3.0,0.6mg·kg-1)和6-姜酚組(10mg·kg-1)。每天2次,連續(xù)灌服3天。2.2ult1a1和gst活性的測定小鼠肝臟微粒體和胞漿液的制備,依據(jù)文獻方法進行。最后所得微粒體,用于測定UGT活性;而胞漿液,用于測定SULT1A1和GST活性。以小牛血清標準蛋白作參照,用Bradford法,定量微粒體和胞漿液中的蛋白質(zhì)含量。2.3標準曲線的建立UGT活性測定主要依據(jù)文獻進行。最后以系列苯胺濃度為橫坐標(X)和吸光度值為縱坐標(Y)進行線性回歸,得標準曲線:Y=0.12X+1.70×10-3;γ=0.9997,以此計算UGT活性。2.4gsh濃度變化GST具有催化還原型谷胱甘肽(GSH)與1-氯-2,4-二硝基苯結(jié)合的能力,在一定反應(yīng)時間內(nèi),其活性高低,與反應(yīng)前后GSH濃度的變化呈線性關(guān)系。GST活性測定,嚴格按照GST活性測定試劑盒說明書進行。2.5-硝基酚硫酸鹽標準SULT1A1活性測定方法,主要依據(jù)文獻并稍作修改。取0.5mol·L-1(pH6.5或pH5.5)的醋酸鈉緩沖液200μL、0.1mol·L-12-巰基乙醇30μL、待測胞質(zhì)液130μL、5mmol·L-14-硝基苯酚(或2-萘酚)溶液20μL及4mmol·L-1PAPS溶液20μL,混勻;恒溫孵育60min后,加入亞甲基藍溶液,進行顯色反應(yīng)。最后于651nm處,測定吸光度值。以標準4-硝基酚硫酸鹽(或2-萘酚硫酸鹽)系列濃度值為橫坐標(X),吸光度值為縱坐標(Y)進行線性回歸,得如下線性回歸方程。4-硝基酚硫酸鹽:Y=0.62X+0.04,γ=0.9984(pH5.5);Y=0.65X-0.08,γ=0.9972(pH6.5);2-萘酚硫酸鹽:Y=1.54X-0.07,γ=0.9992(pH5.5);Y=0.26X-0.01,γ=0.9970(pH6.5)。線性范圍均在0.06~2.50μmol·mL-1。2.6目的基因表達水平檢測肝組織總mRNA的提取和RT-PCR反應(yīng),均按照TaKaRa公司試劑盒說明書進行。特異性引物序列,根據(jù)文獻進行設(shè)計,均由上海生工生物工程有限公司合成,見表1。PCR擴增反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30s,然后進入40個循環(huán)階段。每個循環(huán)包括95℃,15s;56℃,30s;72℃,31s。最后以同一份目的基因表達量與GAPDH的比值,表示目的基因的表達水平;然后計算供試物組小鼠與純水組小鼠中目的基因表達水平的比值。3統(tǒng)計分析結(jié)果用Mean±SD表示,用SPSS16.0統(tǒng)計軟件,進行組間t檢驗,取P<0.05為具有顯著性差異。結(jié)果1小鼠肝臟gst活性的測定姜油高劑量組小鼠肝臟中,UGT活性與溶媒對照組相比具有顯著性差異(P<0.05);而其他劑量組與溶媒組相比不具有顯著性差異,結(jié)果見表2。姜油高劑量組小鼠肝臟中GST活性與對照組相比具有顯著性差異(P<0.01),而其他劑量組不具有明顯差異,結(jié)果見表2。2種反應(yīng)體系下,以2-萘酚和4-硝基酚為底物,測定酶活性時,姜油高、中劑量組小鼠肝臟中,SULT1A1活性與溶媒對照組相比均有顯著性差異(P<0.01或P<0.05);而低劑量組與對照組相比無顯著性差異,結(jié)果見表2。2ult1a1mrna含量測定姜油高劑量組中,UGT1A1mRNA含量與對照組相比無顯著性差異(P>0.05);而6-姜酚組中,UGT1A1mRNA含量明顯高于對照組(P<0.05),結(jié)果如圖1A所示。姜油高劑量組中,SULT1A1mRNA含量與對照組相比無顯著性差異(P>0.05);而6-姜酚組中,SULT1A1mRNA含量明顯高于對照組(P<0.01),結(jié)果如圖1B所示。不同姜油對創(chuàng)新小鼠肝臟及腸道取樣活性的影響本研究在測定小鼠SULT1A1活性時,分別在pH5.5和pH6.5的反應(yīng)體系中進行測定。結(jié)果表明,pH6.5的反應(yīng)體系更有利于SULT1A1活性的發(fā)揮。雖然在2種反應(yīng)體系中,姜油均能誘導(dǎo)SULT1A1對2種底物的催化活性;但姜油高劑量時(15mg·kg-1)不能誘導(dǎo)SULT1A1mRNA的表達;而6-姜酚在10mg·kg-1時,能顯著提高SULT1A1mRNA的表達水平,這可能系15mg·kg-1的姜油內(nèi)僅含6-姜酚1.2mg·kg-1,故認為未達到顯效劑量。飲食當中有很多成分能通過誘導(dǎo)GST的活性,來抑制胃腸癌的發(fā)病機率,比如蘿卜硫素、D-檸檬烯和萘丁美酮,均能夠誘導(dǎo)肝臟和腸道當中的GSTα活性以及胃和小腸中的GSTμ和GSTπ活性等。因此姜油對GST的誘導(dǎo)作