lc-msms法測定人血漿中氯雷他定濃度及其生物等效性評價

lc-msms法測定人血漿中氯雷他定濃度及其生物等效性評價

氯仿-1的化學(xué)名稱為4-（8-氯-5，6-二羥基-11h-苯并環(huán)）-1-吡啶丙烯酸-乙酰胺。這是第二代抗凝劑，用于競爭菲涅耳第一胺受體，并抑制菲涅耳第一胺引起的過敏癥狀。對變態(tài)反應(yīng)中黏附分子的表達有抑制作用,尤其對于細胞間黏附分子與血管細胞黏附分子的表達有明顯抑制作用,可降低炎癥細胞向過敏灶的趨化,從而控制過敏的遲發(fā)相反應(yīng)。氯雷他定口服制劑臨床上用于緩解過敏性鼻炎有關(guān)的癥狀,如噴嚏、流涕、鼻癢鼻塞以及眼部癢和燒灼感,口服藥物后鼻和眼部癥狀及體征得以迅速緩解;亦適用于緩解慢性蕁麻疹、瘙癢性皮膚病及其他過敏性皮膚病的癥狀及體征。近幾年,國內(nèi)外對人血漿氯雷他定濃度的測定方法有液相色譜紫外檢測法(LC-UV)、液相色譜熒光檢測法(LC-FD)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)等,但都存在一定的局限性。如:樣本處理過程復(fù)雜,采用多次液-液萃取的方法或采用比較昂貴的固相萃取法;樣本處理方法血漿用量大(>500μL),流動相用量大(>0.5mL·min-1),檢測時間長(>5min)等。另外,氯雷他定在體內(nèi)主要經(jīng)CYP3A4和CYP2D6代謝,其體內(nèi)暴露量(Cmax和AUC)受遺傳多態(tài)性的影響而存在較大的個體間差異,現(xiàn)有報道的研究數(shù)據(jù)已顯示這些特征[1,2,3,4,5,6,8,9,10,11]。因此,若采用氯雷他定口服制劑的臨床單次常用劑量10mg為給藥劑量進行藥動學(xué)及生物等效性研究,上述部分方法在定量范圍方面還存在局限性,如:靈敏度較低[1,2,3,4,5,7,8,10,11],無法滿足測定3～5個消除半衰期時樣本中的藥物濃度或檢測出Cmax的1/10～1/20的藥物濃度;定量上限(ULOQ)較低,不能直接測定部分高濃度的生物樣本,而需要進行稀釋復(fù)測。本實驗建立了快速、靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強、重復(fù)性好的LC-MS/MS方法,成功應(yīng)用于22名健康受試者單次口服10mg氯雷他定片受試制劑和參比制劑后血漿氯雷他定濃度的測定,并評價了兩種制劑的生物等效性。儀器、藥品和試劑API3200型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子化源(ESI)以及Analyst1.4.2數(shù)據(jù)處理軟件,美國AppliedBiosystems公司);Prominence20A液相色譜儀(包括LC20AD型二元泵,DGU20A3型脫氣機,SIL20A型自動進樣器,CTO20A型柱溫箱,CBM20A系統(tǒng)控制器,日本Shimadzu公司);QB600型高速振蕩混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);Sigma318K臺式高速離心機(德國SartoriusStedimBiotech公司);MTN2800D氮吹濃縮裝置(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。氯雷他定片(受試制劑,規(guī)格:每片10mg,北京京豐制藥有限公司,批號:101201);氯雷他定片(商品名:開瑞坦,參比制劑,規(guī)格:每片10mg,上海先靈葆雅制藥有限公司,批號:09DRXF1008);氯雷他定對照品(純度為100.06%,北京京豐制藥有限公司,批號:0811191);地西泮對照品(內(nèi)標(biāo),純度為99.9%,中國食品藥品檢定研究院,批號:171225-200903)。甲醇(色譜純,美國Fisher公司,批號:102100);超純水(由蒸餾水經(jīng)KLZ艾柯純水機純化后制得);其他試劑均為分析純?？瞻兹搜獫{由航天中心醫(yī)院提供或來自于健康受試者。方法和結(jié)果1層析條件和層析條件1.1kx-ods18柱在線過濾器(0.5μm,日本Shimadzu公司);分析柱:Shim-packXR-ODSC18柱(75mm×3mm,2.2μm,日本Shimadzu公司);流動相:甲醇-2mmol·L-1乙酸銨(90∶10);洗脫方式:等度洗脫;流速:0.30mL·min-1;柱溫:30℃;進樣量:10μL。1.2氣體、空氣動力學(xué)離子源:電噴霧離子源(ESI),正離子方式監(jiān)測;離子噴射電壓:4500V;溫度:550℃;源內(nèi)氣體1(GS1,N2)壓力:276kPa;氣體2(GS2,N2)壓力:310kPa;氣簾氣體(N2)壓力:138kPa;碰撞氣(CAD,N2)壓力:21kPa;掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM);用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z383.1→m/z337.1(氯雷他定)和m/z285.2→m/z193.2(地西泮),解簇電壓(DP)分別為60和57V,碰撞能量(CE)分別為29和38eV;Q1和Q3分辨率均為LOW。2溶液和血漿樣本的制備2.1氯雷定儲存溶液的制備稱取適量氯雷他定對照品,加甲醇-水(1∶1)溶解并稀釋至刻度,配制成濃度為32.0μg·mL-1的氯雷他定儲備液。2.2對照品血漿分別取適量氯雷他定儲備液,用空白血漿稀釋成濃度分別為0.0300,0.0900,0.500,2.50,10.0,20.0,40.0ng·mL-1的對照品血漿。2.3樣品質(zhì)量控制結(jié)構(gòu)的制備分別取適量氯雷他定儲備液,用空白血漿稀釋成濃度分別為0.0900,2.50,32.0ng·mL-1的質(zhì)控樣本。2.4由質(zhì)量控制溶液制備分別取適量氯雷他定儲備液,用乙腈稀釋成濃度分別為0.900,25.0,320ng·mL-1的質(zhì)控溶液。2.5地西常用地西常用儲備液稱取適量地西泮對照品,加甲醇-水(1∶1)溶解并稀釋至刻度,配制成濃度為100μg·mL-1的地西泮儲備液。取適量地西泮儲備液,用甲醇-水(1∶1)稀釋成濃度為50.0ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。3lc-ms/ms分析精密取血漿樣本500μL置于10mL玻璃管中,加入內(nèi)標(biāo)溶液100μL、0.5mol·L-1氫氧化鈉溶液100μL、乙醚-正己烷(1∶1)3mL,渦流2min,3500r·min-1離心5min,上清液轉(zhuǎn)移至另一10mL玻璃試管,于40℃恒溫浴下氮氣吹干,殘渣用甲醇-水(1∶1)150μL復(fù)溶,渦流30s,復(fù)溶后的溶液全部轉(zhuǎn)移至進樣瓶中進行LC-MS/MS分析。4分析的證實4.1ms/ms分析分別將氯雷他定、地西泮儲備液稀釋成濃度為1.00μg·mL-1的溶液,采用蠕動泵以10μL·min-1的恒定速度泵入MS/MS系統(tǒng),進行碎片離子分析,相應(yīng)的二級全掃描質(zhì)譜圖見圖1。4.2血漿樣品測定分別取6名健康受試者的空白血漿[加入等體積甲醇-水(1∶1)代替內(nèi)標(biāo)溶液],對照品血漿和健康受試者口服氯雷他定片后的血漿樣本,按“3”項方法處理,其典型色譜圖示于圖2。氯雷他定和地西泮的保留時間分別為2.45和1.85min,血漿中內(nèi)源性物質(zhì)在氯雷他定和內(nèi)標(biāo)地西泮出峰處均無雜峰。4.3內(nèi)源性物質(zhì)對氯雷他定和地西材料的基質(zhì)效應(yīng)因子的確定按“3”項方法處理6個不同來源空白血漿,得到空白血漿基質(zhì)后,再加入低、中、高3個濃度的質(zhì)控溶液及內(nèi)標(biāo)溶液,以其進樣得到的峰面積除以相應(yīng)濃度的質(zhì)控溶液及內(nèi)標(biāo)溶液直接進樣得到的峰面積,計算血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對氯雷他定和地西泮的基質(zhì)效應(yīng)因子。血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對低、中、高3個濃度的氯雷他定的基質(zhì)效應(yīng)因子分別為:(63.6±3.3)%,(68.5±2.4)%,(75.6±1.8)%,平均基質(zhì)效應(yīng)因子為(69.2±5.6)%,血漿內(nèi)源性物質(zhì)對內(nèi)標(biāo)地西泮的基質(zhì)效應(yīng)因子為(65.6±4.1)%。4.4方法的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法檢出限按“3”項方法處理對照品血漿,以血漿中待測物濃度為橫坐標(biāo)(X,ng·mL-1),待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y),用加權(quán)(W=1/X2)最小二乘法進行回歸運算,求得的直線回歸方程為:Y=0.0822X-4.09×10-4(r=0.9991),本方法測定人血漿中氯雷他定濃度的線性范圍為0.0300～40.0ng·mL-1。按“3”項方法處理濃度為0.0300ng·mL-1的對照品血漿,進行6樣本分析,連續(xù)測定3d。根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算每一樣本的濃度。結(jié)果見表1,批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)均小于15%,相對誤差(RE)均在±15%的范圍以內(nèi),本方法測定人血漿中氯雷他定濃度的定量下限為0.0300ng·mL-1。4.5質(zhì)控樣本測定按“3”項方法處理質(zhì)控樣本,每一濃度進行6樣本分析,連續(xù)測定3d。根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算質(zhì)控樣本的測定濃度。準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果見表1,批內(nèi)、批間RSD均小于15%,RE均在±15%的范圍以內(nèi)。4.6提取回收率的測定按“3”項方法處理低、中、高3個濃度的質(zhì)控樣本,以其進樣得到的峰面積除以空白血漿經(jīng)處理后再加入低、中、高3個濃度的質(zhì)控溶液及內(nèi)標(biāo)溶液后進樣得到的峰面積,計算血漿中氯雷他定和地西泮的提取回收率。血漿中低、中、高3個濃度的氯雷他定的提取回收率分別為:(89.0±7.0)%,(99.6±3.9)%,(92.7±3.5)%,平均提取回收率為(93.8±6.5)%,血漿中地西泮的提取回收率為(96.5±4.1)%。4.7氯雷他定的穩(wěn)定性按“3”項方法處理質(zhì)控樣本,每一濃度進行3樣本分析,考察血漿樣本室溫放置8h、經(jīng)3次凍融、-80℃冰凍放置26d,以及血漿樣本經(jīng)處理后于自動進樣器中室溫放置9h后氯雷他定的穩(wěn)定性。結(jié)果見表2,測定濃度與理論濃度的RE均在±9%以內(nèi),表明在血漿樣本室溫放置、反復(fù)凍融、長期冰凍放置過程中,以及處理后分析測定過程中,氯雷他定均較為穩(wěn)定,各種貯存條件不影響對樣本濃度進行準(zhǔn)確測定。此外,氯雷他定儲備液、內(nèi)標(biāo)溶液于4℃放置32d,以及內(nèi)標(biāo)溶液于室溫放置24h均穩(wěn)定。5生物等效研究5.1分組、治療和隨訪22名中國健康男性受試者,年齡(24±3)歲,體重(60.9±5.3)kg,身高(1.72±0.05)m,體重指數(shù)(20±1)kg·m-2。試驗前進行病史詢問和體格檢查,血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能及心電圖檢查等均正常。受試者試驗前2周及試驗期間未服用任何藥物,試驗期間禁煙酒或含咖啡因的飲料。受試者了解試驗?zāi)康摹⒎椒?、意義以及可能發(fā)生的不良反應(yīng)后簽署知情同意書。試驗方案經(jīng)航天中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。5.2氯雷他定片藥物治療本研究采用雙周期2制劑交叉試驗設(shè)計,22名受試者隨機分為2組,交叉服用受試制劑和參比制劑,清洗期為10d。受試者隔夜禁食后,于試驗當(dāng)日清晨8:00空腹口服氯雷他定片受試制劑或參比制劑,劑量均為10mg,用200mL溫開水送服。服藥2h后統(tǒng)一飲水,4h后統(tǒng)一進低脂清淡飲食。于受試者服藥前(0h)和服藥后0.17,0.33,0.50,0.75,1,1.25,1.5,1.75,2,4,6,10,24,36,48h于上肢靜脈取血約4mL置于肝素化試管中,2500r·min-1離心10min,取血漿,立即置于-80℃冰箱中保存?zhèn)錅y。5.3血藥濃度結(jié)果應(yīng)用本研究中建立的LC-MS/MS法測定22名受試者口服受試制劑和參比制劑后不同時間血漿氯雷他定濃度,平均血藥濃度-時間曲線見圖3。采用DAS2.1.1軟件、非房室模型方法計算各主要藥動學(xué)參數(shù),結(jié)果見表3。5.4氯雷他定片與參比制劑間auc0t的比較表5相對生物利用度(F)=(AUC受試制劑/AUC參比制劑)×100%,以上述公式分別計算每名受試者口服氯雷他定片受試制劑相對于參比制劑的相對生物利用度,然后計算平均相對生物利用度。氯雷他定片受試制劑相對于參比制劑的平均相對生物利用度為(100.5±34.1)%(以AUC0～t計),(101.7±34.8)%(以AUC0～∞計)。將AUC0～t,AUC0～∞和Cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行方差分析、雙向單側(cè)t檢驗和90%置信區(qū)間計算,將Tmax進行配對Wilcoxon法檢驗。結(jié)果表明,氯雷他定片受試制劑和參比制劑間AUC0～t,AUC0～∞,Cmax差異無統(tǒng)計學(xué)意義;受試制劑的AUC0～t,AUC0～∞,Cmax沒有超過規(guī)定的參比制劑的高限和低限;受試制劑和參比制劑的AUC0～t和AUC0～∞幾何均數(shù)比值分別為94.9%和95.8%,90%置信區(qū)間分別為85.3%～105.7%和85.8%～107.0%,在80%～125%的范圍內(nèi),受試制劑和參比制劑的Cmax幾何均數(shù)比值為90.8%,90%置信區(qū)間為75.6%～109.0%,在70%～143%的范圍內(nèi);受試制劑和參比制劑間Tmax差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此,受試制劑與參比制劑具有生物等效性。質(zhì)譜條件的影響本研究建立了測定人血漿氯雷他定濃度的LC-MS/MS方法。在血漿樣本的處理方面,考察了堿化試劑NaOH的濃度對提取回收率的影響,結(jié)果表明,每500μL血漿樣本使用濃度為0.5mol·L-1的NaOH100μL進行堿化,可在確保氯雷他定穩(wěn)定的同時,通過一次簡單的液-液萃取,使提取回收率達到90%以上,且重現(xiàn)性好。通過優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜條件,不僅縮短檢測時間,減少血漿樣本中基質(zhì)對氯雷他定和內(nèi)標(biāo)地西泮測定的影響,同時增加方法的靈敏度,擴大定量范圍,減少血漿用量。另外,氯雷他定在體內(nèi)主要經(jīng)CYP3A4和CYP2D6代謝,其體內(nèi)暴露量(Cmax和AUC)受CYP3A4和CYP2D6遺傳多態(tài)性的影響較大,存在顯著的個體間差異(圖3和表3均有顯示),而氯雷他定口服制劑的臨床單次常用劑量為10mg,應(yīng)首選該劑量進行人體生物等效性研究,并且測定方法的LLOQ至少應(yīng)達到