重組酶介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增（RAA）檢測布氏桿菌方法的建立

北京理工大學(xué)珠海學(xué)院2020屆本科生畢業(yè)論文PAGE3重組酶介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增（RAA）檢測布氏桿菌方法的建立摘要[目的]篩選出現(xiàn)現(xiàn)有的布氏桿菌所有種屬的共同基因片段，設(shè)計(jì)出適用于擴(kuò)增目標(biāo)基因的布氏桿菌引物及探針，應(yīng)用重組酶介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增（RAA）技術(shù)建立檢測布氏桿菌的方法，并對該檢測方法進(jìn)行優(yōu)化。[方法]（1）在DNA序列數(shù)據(jù)庫中找到布氏桿菌的多序列基因片段，對找到的多個(gè)特定基因序列進(jìn)行對比分析，篩選出適合通用檢測的布氏桿菌基因序列，根據(jù)篩選出的基因序列，利用設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物及探針；（2）提取核酸的方法；（3）應(yīng)用重組酶介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（RAA技術(shù)）建立檢測布氏桿菌的新方法；（4）對建立的RAA技術(shù)檢測布氏桿菌的新方法進(jìn)行靈敏性、特異性、重復(fù)性試驗(yàn)，對實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。[結(jié)果]本研究成功利用重組酶介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)建立了檢測布氏桿菌的的新方法。全擴(kuò)增反應(yīng)在39℃恒溫進(jìn)行，擴(kuò)增時(shí)間20分鐘。該方法靈敏性最低可檢測到100拷貝的含布氏桿菌的重組質(zhì)粒，且該方法的特異性高，與現(xiàn)有的布氏桿菌宿主身上常見菌種及病毒不發(fā)生非特異性擴(kuò)增。該方法的所用引物是以現(xiàn)有布氏桿菌全種型通用為目標(biāo)制成，在現(xiàn)有樣品的測試下，都可以檢測出陽性，且重復(fù)性高。[結(jié)論]本研究應(yīng)用的RAA技術(shù)檢測布氏桿菌的方法是具有快速、簡便、高靈敏性、特異性好、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。適用于畜牧業(yè)實(shí)地檢測或?qū)W校、實(shí)驗(yàn)室對樣品進(jìn)行研究前的快速檢測。由于疫情和布氏桿菌高危險(xiǎn)性的原因，本研究建立的方法還具有極大的改進(jìn)空間，后續(xù)研究中，需要收集更多不同部位、不同種屬類別的含布氏桿菌樣品，加強(qiáng)本方法的可靠性，且該方法的重復(fù)性、靈敏性還可以進(jìn)行更多實(shí)驗(yàn)完善。關(guān)鍵詞：布氏桿菌；等溫核酸擴(kuò)增；實(shí)地檢測Abstract[Objective]ThecommongenefragmentsofallspeciesandgeneraofBrucellawerescreened,andtheprimersandprobessuitableforamplificationoftargetgenesweredesigned.ThemethodofdetectionofBrucellawasestablishedandoptimizedbyusingrecombinantenzyme-mediatedisothermalnucleicacidamplificationtechnology.[Methods](1)ThemultisequencegenefragmentsofBrucellawerefoundintheDNAsequencedatabase,andthespecificgenesequenceswerecomparedandanalyzed.Thegenesequencessuitableforgeneraldetectionwereselected.Accordingtotheselectedgenesequences,primersandprobesweredesignedbyusingthedesignsoftware;(2)Methodofextractingnucleicacid;(3)ToestablishanewmethodfordetectionofBrucellabyrecombinantenzymemediatedisothermalnucleicacidamplification(RAA);(4)Thesensitivity,specificityandrepeatabilityofthenewmethodfordetectionofBrucellaweretested.[Results]Inthisstudy,anewmethodforthedetectionofBrucellawassuccessfullyestablishedbyusingrecombinantenzymemediatedisothermalnucleicacidamplification.Thewholeamplificationwascarriedoutat39℃for20minutes.Thesensitivityofthismethodisaslowas100copiesofrecombinantplasmidscontainingBrucella,andthespecificityofthismethodishigh,andthereisnonon-specificamplificationwiththecommonbacteriaandvirusesontheexistingBrucellahost.TheprimersusedinthismethodaremadefromallkindsofBrucella.Underthetestofexistingsamples,theycanbedetectedpositiveandhavehighrepeatability.[Conclusions]Inthisstudy,therecombinantenzyme-mediatedisothermalnucleicacidamplificationtechnologyfordetectionofBrucellaisrapid,simple,highlysensitive,specificandreproducible.Itissuitableforthefieldtestingofanimalhusbandryortherapidtestingofsamplesbeforetheresearchinschoolsandlaboratories.DuetotheepidemicsituationandhighriskofBrucella,themethodestablishedinthisstudyhasgreatroomforimprovement.Inthefollow-upstudy,moresamplescontainingBrucellafromdifferentpartsanddifferentspeciesandcategoriesneedtobecollectedtoenhancethereliabilityofthismethod,andtherepeatabilityandsensitivityofthismethodcanbefurtherimproved.Keywords:Brucella;Isothermalnucleicacidamplification;Fielddetection目錄237161前言 1300371.1研究背景 174281.2本實(shí)驗(yàn)研究意義 2153311.3我的研究 371532實(shí)驗(yàn)方案 526822.1實(shí)驗(yàn)材料 512042.1.1實(shí)驗(yàn)菌種（核酸） 5119602.1.2實(shí)驗(yàn)主要儀器 5266312.1.3主要實(shí)驗(yàn)試劑 6209192.2實(shí)驗(yàn)方法 8247642.2.1引物設(shè)計(jì) 8267852.2.2核酸提取 998672.2.3凝膠電泳實(shí)驗(yàn) 10201452.2.4建立RAA檢測布氏桿菌的方法 11185593實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 1318763.1設(shè)計(jì)引物篩選的結(jié)果與分析 1213993.2靈敏性試驗(yàn)結(jié)果與分析 2119423.3特異性試驗(yàn)結(jié)果與分析 339863.4重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果與分析 376063.5樣品檢驗(yàn)結(jié)果與分析 528194結(jié)論 615523參考文獻(xiàn) 114622謝辭 31前言1.1研究背景布氏桿菌（Brucella），又翻譯為布魯氏菌（是由感染布魯氏桿菌所得的布魯氏菌病,學(xué)術(shù)上常稱布病），是一類革蘭氏陰性的短小桿菌。感染布氏桿菌后所患的布氏桿菌病是全世界范圍內(nèi)的人畜共患病，是一種侵害關(guān)節(jié)和生殖系統(tǒng)的慢性流行性疾病【1】。布氏桿菌屬包括傳統(tǒng)的馬爾它布氏桿菌(主要感染山羊和綿羊)、綿羊種布氏桿菌（該菌極其影響綿羊的養(yǎng)殖，引起綿羊布魯氏菌病，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失）、牛種布氏桿菌（主要感染牛）、豬種布氏桿菌（主要感染豬和野兔）、沙林鼠種布氏桿菌（從沙漠大鼠及新生夜蛾中分離。該種布氏桿菌對沙漠木鼠中不具有致病性，但可使其他嚙齒動(dòng)物中引起輕度疾?。⑷N布氏桿菌（主要感染狗）和新發(fā)現(xiàn)的鯨種布氏桿菌（從海豹，海豚和其他海洋哺乳動(dòng)物中分離）、鰭種布氏桿菌、田鼠種布氏桿菌（于2000年從捷克共和國的田鼠體內(nèi)分離）、赤狐種布氏桿菌（從奧地利受感染的赤狐身上分離）、小云雀種布氏桿菌（主要感染鳥類）、狒狒種布氏桿菌（從狒狒體內(nèi)分離）及從兩棲類動(dòng)物和感染的人乳房組織中提取的暫無被傳統(tǒng)方法描述或物種名稱沒被有效公布的一類布氏桿菌（從兩棲類動(dòng)物身上提取且經(jīng)培養(yǎng)后能在人乳房中存活）【2】。畜牧業(yè)中常見的三種布氏桿菌為豬、牛、羊三種，即牛流產(chǎn)桿菌（也叫盤格氏桿菌）、馬耳他熱（波狀熱）桿菌或叫山羊流產(chǎn)桿菌。分別為牛、羊、豬的布氏桿菌，在個(gè)別情況下，也可相互感染【3】。布氏桿菌生活力極強(qiáng)，記錄中，在泥土中能生存最多存活103天，在水中能生存最多114天，夏季時(shí)在糞便中能生存1-3天，而在低溫下能生存大致160天，在畜牧的干胎膜中能生存120天左右，在乳中能存活10天，在奶油中都能生存41天以上，在干奶酪中能生存42天。它在寒冷天氣能生存數(shù)月之久。距長久以來的資料記載，消化道、皮膚及黏膜是布氏桿菌病侵入體內(nèi)的重要途徑，交配也可以直接傳染。含布氏桿菌的胎盤、糞便尿液和畜牧場中墊草等也是主要的傳染媒介。由于布氏桿菌自身的特點(diǎn)，治療起來比較麻煩且容易反復(fù)【4】。在臨床上，牲畜患該病有以下一種或幾種特征：流產(chǎn)、胎衣不下、睪丸炎、附睪炎，較少有關(guān)節(jié)炎等癥狀【5】。人類感染布氏桿菌病后易低燒、無力、全身酸痛等癥狀，男性易引發(fā)睪丸感染，而女性常容易引發(fā)生殖系統(tǒng)（如乳房、卵巢及子宮內(nèi)膜等部位）的感染等。對處于孕期的女性還容易造成流產(chǎn)。很多患者會有長時(shí)間的發(fā)熱。據(jù)病程長短分類，布氏桿菌病分為急性（少于8周）、亞急性（8-52周）、慢性（一年以上）。發(fā)燒、不適、頭痛、出汗、腰痛和關(guān)節(jié)痛是急性布氏桿菌病最常見的癥狀。亞急性布氏桿菌病是指，在布氏桿菌的治療中，由于不完全或部分的抗生素治療而復(fù)發(fā)，以及由于診斷錯(cuò)誤而接受了不適當(dāng)?shù)目股刂委煹牟“Y。癥狀較輕微，有疲勞、頭痛和肌痛。此外，局部感染如附睪炎、睪丸炎和骨關(guān)節(jié)并發(fā)癥更為常見。慢性布氏桿菌病與慢性疲勞綜合征相似。這種情況在兒童中極為罕見，但在老年人中較為常見。這些病人通?；加芯裆窠?jīng)癥、出汗和體重減輕。發(fā)熱現(xiàn)象罕見，可見局部感染。然而，常見如葡萄膜炎和葡萄膜炎等眼部癥狀表現(xiàn)。布氏桿菌感染還會引起許多系統(tǒng)的并發(fā)癥【6】。在許多系列中，布氏桿菌病的骨關(guān)節(jié)并發(fā)癥最常見，包括骶髂關(guān)節(jié)炎、周圍關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎、脊椎炎、骨髓炎和滑囊炎。腸胃系統(tǒng)的癥狀有厭食、腹瀉或便秘，更嚴(yán)重的并發(fā)癥如腸系膜淋巴結(jié)炎，肝或脾受累，或膽囊炎也時(shí)常見到報(bào)道。甚至危及生命的并發(fā)癥也不少發(fā)生，如回腸炎、結(jié)腸炎和自發(fā)性腹膜炎。豬鏈球菌感染可引起肝膿腫和肝脾慢性化膿性病變。盡管呼吸系統(tǒng)被認(rèn)為是布氏桿菌病的傳播途徑，但肺部并發(fā)癥較為罕見。有一些呼吸道疾病的報(bào)告，如肺門和氣管旁淋巴結(jié)病，間質(zhì)性肺炎、肺結(jié)節(jié)、胸腔積液和膿胸。急性睪丸炎或附睪睪丸炎是泌尿生殖系統(tǒng)并發(fā)癥的主要表現(xiàn)。胎兒的癥狀包括流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎。據(jù)報(bào)道，腦膜炎為神經(jīng)系統(tǒng)最常見的癥狀。其他并發(fā)癥很少見，如心肌炎、心包炎和主動(dòng)脈及腦血管的動(dòng)脈瘤。許多動(dòng)物都可以感染此病，如：牛、羊、豬、馬、駱駝、驢、騾，家禽和鹿等。動(dòng)物感染布氏桿菌確診后，常根據(jù)其有無治療價(jià)值判斷是否進(jìn)行后續(xù)的處理，一般情況下動(dòng)物會被進(jìn)行無害化處理，防止布氏桿菌病情進(jìn)一步擴(kuò)散。如受感染動(dòng)物仍具有較大的治療價(jià)值，畜牧場常使用抗生素藥物并配合消毒措施對受感染動(dòng)物進(jìn)行治療。但是病情防控上并不提倡常用抗生素，原因是避免疫情發(fā)生擴(kuò)大化，且避免出現(xiàn)后續(xù)耐藥菌株【7】。1.2本實(shí)驗(yàn)研究意義有效防控布氏桿菌是目前關(guān)乎畜牧業(yè)發(fā)展及人民正常生產(chǎn)生活的重要任務(wù)?！皞鹘y(tǒng)”布氏桿菌常年對國家畜牧業(yè)造成重大損失，也危害著人們的身體健康。新進(jìn)發(fā)現(xiàn)的布氏桿菌將帶給布氏桿菌防控任務(wù)更大的挑戰(zhàn)。由此，建立更高效的布氏桿菌檢測方法是必要的長期任務(wù)。目前畜牧業(yè)中傳染的布氏桿菌病以下幾點(diǎn)途徑[8-9]：經(jīng)過對高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖場養(yǎng)殖所用草料?；煊信Ｑ蚣S便及流產(chǎn)干尸等物。部分養(yǎng)殖場私買凍精配種、操作不規(guī)范、衛(wèi)生條件不合格等；因畜牧價(jià)格波動(dòng)及養(yǎng)殖規(guī)模波動(dòng)，部分地區(qū)不經(jīng)檢疫從外地購入，導(dǎo)致當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場畜牧感染布氏桿菌病風(fēng)險(xiǎn)增加；牧民飲用生鮮羊牛乳、運(yùn)送鮮奶車輛不進(jìn)行檢疫，增大人感染布氏桿菌病風(fēng)險(xiǎn)；部分地區(qū)宰殺畜牧并無對畜牧樣品進(jìn)行嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室檢疫，單查看動(dòng)物檢疫證明并不能有效防控布氏桿菌。養(yǎng)殖業(yè)需采取有效措施降低畜牧感染布氏桿菌病的風(fēng)險(xiǎn)。對養(yǎng)殖場中畜牧進(jìn)行反復(fù)檢測，檢測出布氏桿菌的養(yǎng)殖場每二個(gè)月檢測一次。如檢測到布氏桿菌陽性的畜牧，應(yīng)就地?fù)錃?。疑是有布氏桿菌病癥狀的畜牧應(yīng)隔離后進(jìn)行復(fù)檢，復(fù)檢合格后才能重新養(yǎng)殖。養(yǎng)殖場中糞便、墊草、畜牧胎盤等物應(yīng)及時(shí)進(jìn)行無害化處理，避免可能存在的布氏桿菌在畜群中傳播。養(yǎng)殖場食槽應(yīng)每日消毒一次，飼養(yǎng)應(yīng)在消毒之后才可進(jìn)行。檢測出布氏桿菌陽性的養(yǎng)殖場應(yīng)進(jìn)行一次徹底消毒，糞便、墊草、畜牧胎盤等物徹底無害化處理，剩余飼料深埋。畜牧幼崽應(yīng)另建干凈飼養(yǎng)舍，且離成年畜牧舍至少500米。畜牧出生后應(yīng)進(jìn)行消毒，且飲用的母乳應(yīng)進(jìn)行高溫消毒及專門哺乳工具畜牧出廠應(yīng)有嚴(yán)格的檢查，需具有專業(yè)檢疫合格證明，運(yùn)輸畜牧車輛使用前后都應(yīng)進(jìn)行消毒。畜牧場工作人員應(yīng)每年進(jìn)行健康體檢[10]。傳統(tǒng)檢測布氏桿菌的方法包括病原學(xué)試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)。病原學(xué)試驗(yàn)有細(xì)菌分離、聚合酶鏈反應(yīng)、顯微鏡檢查等。病原鑒定，對奶、乳制品檢測不敏感，因?yàn)檫@些樣品含菌量較少，而且脂肪滴的存在影響結(jié)果，且其他病原如貝氏柯克斯體和親衣原體屬，兩者可能具有相似形態(tài)，臨床上都會引起流產(chǎn)。此類方法在國際中不被推薦使用。目前主要應(yīng)用血清學(xué)方法進(jìn)行畜群篩選和動(dòng)物個(gè)體檢查，血清學(xué)方法有試管凝集試驗(yàn)（SAT）、緩沖平板凝集試驗(yàn)（BPAT）、虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)、全乳環(huán)狀試驗(yàn)（MPT）、美聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISAs）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）和熒光片振試驗(yàn)（FPA）。但這七種血清學(xué)方法中，沒有任何一種方法能針對所有群體流行病學(xué)的進(jìn)行調(diào)查。各種試驗(yàn)方法在結(jié)果判定及影響因素、檢疫時(shí)間上都多少存在限制。血清學(xué)試驗(yàn)通常需要2-3天才能見到菌落生長，乳、奶制品及某些組織樣品中的布氏桿菌較少，需進(jìn)行6周的增菌培養(yǎng)。傳統(tǒng)上，對布氏桿菌的鑒定應(yīng)采用多種方式聯(lián)合進(jìn)行：菌體以及菌落、革蘭氏染色或Stamp染色、脲酶、生長特性等。但種與屬之間需要更詳細(xì)的檢驗(yàn)，如噬菌體溶解試驗(yàn)、對特異性抗血清的凝集模式[11]。培養(yǎng)常花費(fèi)大量的時(shí)間，且需要嚴(yán)格安全的實(shí)驗(yàn)室來隔離布氏桿菌[12]。傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測在區(qū)分疫苗和野生型毒株方面仍然存在一些困難。還需要進(jìn)行更多的研究。時(shí)至今日，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，針對檢測布氏桿菌的多重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測等方法都先后被開發(fā)出來[13-16]。對比之下，分子檢測具有高敏感度、高特異性等特性。1.3我的研究基于PCR技術(shù)的檢測方法具有敏感度和特異性均較高等優(yōu)點(diǎn)，對實(shí)驗(yàn)人員、實(shí)驗(yàn)設(shè)備及實(shí)驗(yàn)操作場所均有較高要求。雖然在檢測時(shí)間上相較血清學(xué)方法更短，但畜牧業(yè)日益發(fā)展的同時(shí)，必將對檢測的各條件有更簡便快速的要求[17]。本實(shí)驗(yàn)所采用的重組酶介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)脫胎于PCR技術(shù)，其主要特點(diǎn)是能在較低的恒定溫度下擴(kuò)增目標(biāo)基因，且該技術(shù)不依賴太過高級且精細(xì)的儀器設(shè)備、其操作簡單、影響實(shí)驗(yàn)的因素較少、擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間快（一般只需反應(yīng)15分鐘左右）。適用于畜牧業(yè)實(shí)地檢測或?qū)W校、實(shí)驗(yàn)室對樣品進(jìn)行研究前的快速檢測。

2實(shí)驗(yàn)方案2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)菌種（核酸）列表1：實(shí)驗(yàn)樣品菌種及核酸來源滅活牛種布氏桿菌中國疾病預(yù)防控制中心滅活羊種布氏桿菌中國疾病預(yù)防控制中心豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗（EO630株）廣東永順生物制藥股份有限公司豬丹毒活疫苗（GC42株）山東華宏生物工程有限公司豬巴氏桿菌病活疫苗（C4株）廣東永順生物制藥股份有限公司非洲豬瘟病毒核酸拱北海關(guān)動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室口蹄疫病毒核酸拱北海關(guān)動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室豬水皰性口炎病毒核酸拱北海關(guān)動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室豬圓環(huán)病毒核酸拱北海關(guān)動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室布氏桿菌陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)體上海旭冠生物科技有限公司2.1.2實(shí)驗(yàn)主要儀器列表2：實(shí)驗(yàn)主要儀器儀器型號廠家取樣器Research®plusEppendorf干浴器DryBlockHeater4IKA小型離心機(jī)S1010ESclLogex手掌型離心機(jī)LX-100海門市麒麟醫(yī)用儀器廠臺式冷凍離心機(jī)Centrifuge5424REppendorf恒溫?zé)晒鈾z測儀Genchek-1杭州眾測有限公司微波爐NN-GT353M日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社電泳儀PowerpacBasicBIO-RAD凝膠成像儀AlphaimagerHPAlphaInnotech2.1.3主要實(shí)驗(yàn)試劑2.1.3.1實(shí)驗(yàn)試劑(1)組織DNA提取試劑盒組織DNA提取試劑盒（TissueDNAkit）（D3396-02）購買自O(shè)MEGA公司。列表3：組織DNA提取試劑盒的產(chǎn)品組成產(chǎn)品組成數(shù)量規(guī)格微型DNA收集柱200個(gè)2ml收集管400個(gè)BL緩沖液60mlTL緩沖液60mlHBC緩沖液80mlDNA清洗液3×20ml洗脫液120mlOB蛋白酶溶液4×1.4ml(2)RAA試劑盒實(shí)驗(yàn)所用RAA試劑盒購自浙江杭州眾測生物科技有限公司。列表4：RAA試劑盒產(chǎn)品組成產(chǎn)品組成規(guī)格干粉反應(yīng)管48T/盒ABuffer2管（1.3ml/管）BBuffer2管（0.2ml/管）CBuffer1管（70L/管）陽性對照1管（30L/管）（3）凝膠電泳實(shí)驗(yàn)試劑列表5：凝膠電泳實(shí)驗(yàn)試劑試劑生產(chǎn)公司三（羥甲基）氨基甲烷上海生工生物工程股份有限公司硼酸廣州牌化學(xué)試劑廠乙二胺四乙酸二鈉國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司瓊脂糖H上海生工生物工程股份有限公司6XloadigBuffer北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司DL20000DNAMarker北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司GelRed10000XinwaterBiotium2.1.3.2引物列表6：實(shí)驗(yàn)用引物探針或引物序列（5’→3’）探針PCCACAAAGAAATAGGCGTCCAGCGCACCAFCHTQCAGCCTCTCGCCTG-C3-spacerBrucellaF1GAGATTGCGCCCGTCGGATAGCCGCCCACAAAGAABrucellaF2GTTCCGAGATTGCGCCCGTCGGATAGCCGCCCACABrucellaF3GGCCAGTTCCGAGATTGCGCCCGTCGGATAGCCGCBrucellaF4GAGATGGCCAGTTCCGAGATTGCGCCCGTCGGATABrucellaF5CGTTCGAGATGGCCAGTTCCGAGATTGCGCCCGTCBrucellaF6AATACCGTTCGAGATGGCCAGTTCCGAGATTGCGCBrucellaF7GAGCGAAATACCGTTCGAGATGGCCAGTTCCGAGABrucellaF8GGAACGAGCGAAATACCGTTCGAGATGGCCAGTTCBrucellaR1GACGATATCAAGGCTGAACACCTGAAGCCGGGACCBrucellaR2CGGAAGACGATATCAAGGCTGAACACCTGAAGCCGBrucellaR3CCTCACGGAAGACGATATCAAGGCTGAACACCTGABrucellaR4TACGGCCTCACGGAAGACGATATCAAGGCTGAACABrucellaR5AAGCCTACGGCCTCACGGAAGACGATATCAAGGCTBrucellaR6TCTTGAAGCCTACGGCCTCACGGAAGACGATATCABrucellaR7ATCGTTCTTGAAGCCTACGGCCTCACGGAAGACGABrucellaR8CGCGTATCGTTCTTGAAGCCTACGGCCTCACGGAA備注：F：dt-FAM;H：Tetrahydrofuran;Q：dt-BHQ1注：所有引物及探針均由珠海輝睿生物科技有限公司合成。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1引物設(shè)計(jì)(1)RAA技術(shù)體系中引物設(shè)計(jì)原則RAA技術(shù)體系中引物設(shè)計(jì)與常規(guī)的PCR引物存在一定差別。RAA技術(shù)所需的引物由兩條寡核苷酸組成一對引物，分別特異性識別一個(gè)目標(biāo)核酸的上下游核苷酸序列；引物長度在30-35個(gè)核苷酸之間，序列之間沒有回文序列、沒有連續(xù)單堿基重復(fù)序列和內(nèi)部的二級結(jié)構(gòu)區(qū)；設(shè)計(jì)引物時(shí)，主要考慮因素中不包括引物的TM值；最佳引物對需通過實(shí)際試驗(yàn)優(yōu)化及篩選；RAA技術(shù)的擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)為單一條帶，且沒有非特異性擴(kuò)增和明顯的引物二聚體。(2)RAA技術(shù)體系中探針設(shè)計(jì)原則探針序列不與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的特異性引物識別位點(diǎn)重合，且探針序列為46-52個(gè)核苷酸的序列，序列間沒有回文序列、沒有連續(xù)的重復(fù)堿基以及內(nèi)部的二級結(jié)構(gòu)；探針序列共有四個(gè)修飾位點(diǎn)，THF位點(diǎn)的上游標(biāo)記有一個(gè)熒光基團(tuán)，同時(shí)下游標(biāo)記又一個(gè)淬滅基團(tuán)，標(biāo)記的兩個(gè)基團(tuán)之間的間距要求為2-4個(gè)核苷酸；距離5’端不小于35個(gè)核苷酸的中間位置需標(biāo)記一個(gè)dSpacer（四氫呋喃，THF）作為RAA技術(shù)體系中核酸外切酶的識別位點(diǎn)；THF距離3’端不小于15個(gè)核苷酸，且在3’端末端需標(biāo)記一個(gè)特定修飾基團(tuán)，如C3-Spacer。（3）實(shí)驗(yàn)所用引物及探針設(shè)計(jì)流程在DNA序列數(shù)據(jù)庫中檢索布氏桿菌（Brucella）的基因組，下載所有序列后通過DNAStar軟件進(jìn)行多序列比對，根據(jù)比對結(jié)果找到符合條件的基因序列。借助PrimerPremier6.0評估并優(yōu)化得到的序列。根據(jù)設(shè)計(jì)出的基因序列，按探針設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)RAA探針，并利用PrimerPremier6.0進(jìn)行評估優(yōu)化。探針和引物的合成由珠海輝睿生物科技有限公司公司完成。2.2.2核酸提取(1)取來從中國疾病預(yù)防控制中心的各布氏桿菌抗原各30毫克，轉(zhuǎn)移至1.5毫升離心管中；(2)加入200LTL緩沖液；(3)加入25LOB蛋白酶溶液，混合均勻；(4)將1.5ml離心管置于55℃水浴中加熱（一般加熱時(shí)間少于3小時(shí)，時(shí)間取決于所用組織數(shù)量及類型）；(5)將1.5ml離心管放置于冷凍離心機(jī)中離心5分鐘，離心轉(zhuǎn)速不小于10000xg；(6)將1.5ml離心管中混合物的上清液轉(zhuǎn)移至新的潔凈的1.5ml離心管中。注意勿混入不溶性物質(zhì)；(7)加入220LBL緩沖液并充分混合均勻；(8)將離心管在70℃下孵育10分鐘；(9)加入220L無水乙醇并充分混勻；(10)將收集柱插在2毫升的收集管上，將（9）步驟中的混合物轉(zhuǎn)移入DNA收集柱中；(11)將收集管放置于冷凍離心機(jī)中使用最大速度離心1分鐘；(12)離心結(jié)束后，棄去收集管中濾液，并繼續(xù)使用該收集管；(13)將500L的HBC緩沖液加入到DNA收集柱中；(14)在冷凍離心機(jī)中應(yīng)用最大速度將收集管冷凍離心30秒；(15)離心結(jié)束后，棄去收集管及其中的濾液，并將DNA收集柱和新的2ml收集管組合；(16)將700L的DNA清洗液加入到DNA收集柱中并將收集管以最大速度冷凍離心30秒；(17)棄去收集管中的濾液并重新使用該收集管；(18)重復(fù)(16)的步驟;(19)將DNA收集管以最大速度離心2分鐘，這一步驟目的是干燥目的DNA所在的DNA收集柱；(20)將DNA收集柱和新的潔凈1.5ml離心管組合；(21)于70℃下加入100-200微升洗脫液至DNA收集柱；(22)室溫中放置兩分鐘后，將離心管以最大速度離心一分鐘；(23)重復(fù)（21）（22）步驟，得到目的DNA；(24)將得到的DNA放置于-20℃冰箱保存。2.2.3凝膠電泳實(shí)驗(yàn)2.2.3.1 5XTBE緩沖液的配置（1）用分析天平分別稱取54g三（羥甲基）氨基甲烷、27.5g硼酸、4.65g乙二胺四乙酸二鈉，轉(zhuǎn)移至1000ml燒杯中。（2）量取1000mlddH2O，將其中500ml水倒入裝有配置TBE緩沖液的試劑的燒杯中。輕輕攪拌后，將燒杯放入微波爐中加熱至乙二胺四乙酸二鈉溶解。（3）將部分量取的1000mlddH20緩慢加入燒杯中，輕輕攪拌后，利用玻璃棒將燒杯中溶液引流至1000ml的容量瓶中。（4）分?jǐn)?shù)用剩下的ddH2O潤洗燒杯，將潤洗后的溶液轉(zhuǎn)移至容量瓶，當(dāng)容量瓶中液體液面離容量瓶標(biāo)線為0.5cm左右時(shí)，改用滴管小心滴加最后的溶液。（5）塞緊瓶塞并輕輕顛倒混勻容量瓶，待混勻后將配置的TBE緩沖液轉(zhuǎn)移至潔凈的棕色瓶中保存。2.2.3.21XTBE緩沖液的配置將2.2.3.1中配置的5XTBE緩沖液200ml與800mlddH2O混合均勻后，利用攪拌棒將稀釋后的TBE緩沖液轉(zhuǎn)移至潔凈的棕色瓶中保存。2.2.3.3瓊脂糖凝膠的配置（1）稱取3g瓊脂糖，置于燒杯中。加入200ml的1XTBE緩沖液，用玻璃棒輕輕攪拌后，將燒杯置于微波爐中加熱。（2）待瓊脂糖溶解，溶液變澄清后，將燒杯取出。（3）當(dāng)瓊脂糖凝膠液冷卻至65℃左右時(shí)，加入20LGelRed染色劑，充分混勻。2.2.3.4瓊脂糖凝膠電泳（1）將配置好的瓊脂糖凝膠倒入制膠板中，將氣泡趕至制膠板末端，插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，室溫下使瓊脂糖凝膠冷卻凝固。（2）將5L樣品與1L的6XloadingBuffer混合均勻后，轉(zhuǎn)移至瓊脂糖凝膠的加樣孔中。同時(shí)將6L的DL20000DNAMarker、陽性對照、陰性對照分別作為加樣孔中。（3）將電泳儀設(shè)置30分鐘220V的電壓，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。（4）待瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小心地將瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移至凝膠成像儀中，調(diào)整好凝膠塊的位置，打開紫外燈觀察瓊脂糖凝膠中的條帶并拍照保存。2.2.4建立RAA檢測布氏桿菌的方法2.1.4.1RAA反應(yīng)體系在裝有檢測干粉的反應(yīng)單元管中加入40.9L的ABuffer、2L正向引物（10μM）、2微升反向引物（10M）、0.6微升探針（10M）。向檢測單元管中加入2L的樣本DNA，再向檢測單元管蓋上加入2.5L的BBuffer，蓋上管蓋，上下顛倒5-6次，使體系充分混勻，再低速離心10秒鐘。將檢測單元管放入Genchek熒光檢測儀，調(diào)節(jié)RAA程序。如樣品的檢測結(jié)果為陽性，將樣品DNA用瓊脂糖凝膠電泳儀在120V30分鐘檢測后再凝膠成像系統(tǒng)上掃描驗(yàn)證。2.1.4.2陽性試劑的稀釋將上海旭冠生物科技有限公司合成的含布氏桿菌DNA的質(zhì)粒（濃度為1010拷貝數(shù)）從-20℃冰箱中取出，準(zhǔn)備好9管1.5ml離心管，分別在超凈工作臺中注入1管90LddH2O、9管450LddH2O，9管離心管分別標(biāo)記為1-9號管。待質(zhì)粒融化至室溫后，顛倒搖勻，置于微型離心機(jī)中離心數(shù)秒。取1號管（含90LddH2O），從陽性原液管中吸取10L陽性原液，移入1號管中，并多次抽吸使溶液充分混勻。待1號管中的溶液混合均勻后，用移液器吸取50L1號管中的溶液，移入2號管中，反復(fù)抽吸幾次，使溶液充分混合均勻。重復(fù)該操作將質(zhì)粒稀釋至10號管，即將陽性質(zhì)粒原液稀釋至10-10的倍數(shù)。2.1.4.3引物篩選流程針對現(xiàn)有布氏桿菌各種型，利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)出了8對引物。利用RAA技術(shù)篩選出最優(yōu)引物組合，通過觀察最先檢測到熒光的時(shí)間，篩選出靈敏性最好的一對引物。取2L2.1.4.2中稀釋的3號管溶液（即陽性原液稀釋倍數(shù)為10-3）作為樣品，以F1引物為上游引物，依次以R1-R8引物為下游引物，按照2.1.4.1中建立的RAA反應(yīng)體系及條件在恒溫?zé)晒鈾z測儀中進(jìn)行熒光擴(kuò)增，選擇最先檢測到熒光的體系中所用下游引物為最優(yōu)下游引物。取2L2.1.4.2中稀釋的3號管溶液（即陽性原液稀釋倍數(shù)為10-3）作為樣品，以選取的最優(yōu)下游引物為下游引物，依次以F1-F8為上游引物，按照2.1.4.1中建立的RAA反應(yīng)體系及條件在恒溫?zé)晒鈾z測儀中進(jìn)行熒光擴(kuò)增，選擇最先檢測到熒光的體系中所用上游引物為最優(yōu)上游引物。2.1.4.4靈敏性試驗(yàn)將2.1.4.2中的8管陽性試劑（稀釋倍數(shù)分別為10-3-10-10）以2.1.4.1中建立的RAA反應(yīng)體系及條件在恒溫?zé)晒鈾z測儀中進(jìn)行熒光擴(kuò)增。2.1.4.5特異性試驗(yàn)以稀釋倍數(shù)為10-5的布氏桿菌陽性試劑為陽性對照、等量ddH2O為陰性對照，與提取的豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗（EO630株）的核酸、豬丹毒活疫苗（GC42株）的核酸、豬巴氏桿菌病活疫苗（C4株）的核酸、非洲豬瘟病毒核酸、口蹄疫病毒核酸、豬水皰性口炎病毒核酸同時(shí)按照2.1.4.1中建立的RAA反應(yīng)體系及條件在恒溫?zé)晒鈾z測儀中進(jìn)行熒光擴(kuò)增。如樣品的檢測結(jié)果為陽性，將樣品DNA用瓊脂糖凝膠電泳儀在120V30分鐘檢測后再凝膠成像系統(tǒng)上掃描驗(yàn)證。2.1.4.6重復(fù)性試驗(yàn)分別將2.1.4.2中的4、5、6管（稀釋倍數(shù)分別為10-4-10-6），按照2.1.4.1中建立的RAA反應(yīng)體系及條件在恒溫?zé)晒鈾z測儀中進(jìn)行熒光擴(kuò)增。每組中加入的試劑濃度及劑量都相同。2.1.4.7樣品檢驗(yàn)按照2.1.4.1中建立的RAA反應(yīng)體系及條件，將提取的滅活牛種布氏桿菌抗原的核酸、滅活的羊種布氏桿菌抗原的核酸，以稀釋倍數(shù)為10-5的布氏桿菌陽性試劑為陽性對照，以等量ddH2O為陰性對照，在恒溫?zé)晒鈾z測儀中進(jìn)行熒光擴(kuò)增。檢驗(yàn)中，兩管樣品分別設(shè)置一組同樣的對照。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.1設(shè)計(jì)引物篩選的結(jié)果與分析設(shè)計(jì)引物篩選結(jié)果如圖3-1與圖3-2。針對現(xiàn)有布氏桿菌各種型，利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)出了8對引物。利用RAA技術(shù)篩選出最優(yōu)引物組合。本實(shí)驗(yàn)最終選擇F3/R8位最優(yōu)引物組合（如列表7：最優(yōu)引物組合）。圖3-1下游引物篩選結(jié)果圖3-2上游引物篩選結(jié)果列表7：最優(yōu)引物組合引物序列BrucellaF3GGCCAGTTCCGAGATTGCGCCCGTCGGATAGCCGCBrucellaR8CGCGTATCGTTCTTGAAGCCTACGGCCTCACGGAA3.2靈敏性試驗(yàn)結(jié)果與分析靈敏性試驗(yàn)結(jié)果如圖3.3。本實(shí)驗(yàn)利用2.1.3.2中梯度稀釋后8管（稀釋倍數(shù)從10-3-10-10）的含布氏桿菌基因的陽性質(zhì)粒進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2.1.3.1中建立的RAA體系及條件最低能檢測到稀釋倍數(shù)為10-8的含布氏桿菌的重組質(zhì)粒（即100拷貝）。說明該RAA技術(shù)檢測體系具有高靈敏性。圖3-3靈敏性試驗(yàn)結(jié)果注：圖上所標(biāo)數(shù)字對應(yīng)2.1.3.3中1-9號管（即布氏桿菌質(zhì)粒溶液稀釋倍數(shù)為10-3-10-10）3.3特異性試驗(yàn)結(jié)果與分析特異性試驗(yàn)結(jié)果如圖3-4。利用布氏桿菌宿主易患的多種病菌及病毒（如豬多殺性巴氏桿菌、豬丹毒桿菌、豬巴氏桿菌、非洲豬瘟病毒、口蹄疫病毒、豬水皰性口炎病毒）為樣品，檢測2.1.3.1中建立的RAA體系特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，8份樣品中，只有陽性對照檢測出擴(kuò)增現(xiàn)象，即該體系并無出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。說明本實(shí)驗(yàn)建立的RAA體系具有高特異性。圖3-4特異性試驗(yàn)結(jié)果3.4重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果與分析重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果如圖3-5、3-6、3-7。分別將2.1.3.2中的4、5、6管（稀釋倍數(shù)分別為10-4-10-6）按照2.1.3.1中建立的RAA體系及條件做三組重復(fù)性試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)際工作中，樣品檢測時(shí)間誤差基本在一分鐘之內(nèi)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)性取決于操作者的體系配置穩(wěn)定性及體系是否混合均勻。圖3-5稀釋倍數(shù)為10-4的陽性質(zhì)粒溶液重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果圖3-6稀釋倍數(shù)為10-5的陽性質(zhì)粒溶液重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果圖3-7稀釋倍數(shù)為10-6的陽性質(zhì)粒溶液重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果3.5樣品檢驗(yàn)結(jié)果與分析樣品檢驗(yàn)結(jié)果如圖3-8。按照2.1.3.1中建立的RAA反應(yīng)體系及條件，將提取的滅活牛種布氏桿菌抗原的核酸、滅活的羊種布氏桿菌抗原的核酸，以稀釋倍數(shù)為10-5的布氏桿菌陽性試劑為陽性對照，以等量ddH2O為陰性對照，在恒溫?zé)晒鈾z測儀中進(jìn)行熒光擴(kuò)增。檢驗(yàn)中，兩管樣品分別設(shè)置一組同樣的對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在現(xiàn)有樣品的檢測下，本方法檢測布氏桿菌檢出率為100%。圖3-8樣品檢驗(yàn)結(jié)果

4結(jié)論目前，關(guān)于布氏桿菌的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)檢測方法主要為血清學(xué)方法。血清學(xué)的試管凝集試驗(yàn)（SAT）、緩沖平板凝集試驗(yàn)（BPAT）、虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)、全乳環(huán)狀試驗(yàn)（MPT）、美聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISAs）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）和熒光片振試驗(yàn)（FPA）是現(xiàn)行布氏桿菌檢疫的標(biāo)準(zhǔn)方法。利用血清學(xué)方法檢測布氏桿菌所得到的結(jié)果相對可靠，但此類方法耗時(shí)久、操作繁瑣，且針對各種試驗(yàn)方法在結(jié)果判定及影響因素都多少存在限制。奶制品、血清及部分組織含有的布氏桿菌較少，利用血清學(xué)方法檢測需要進(jìn)行6周左右的增菌培養(yǎng)。相比較之下，分子生物學(xué)中的PCR技術(shù)具有高靈敏性、高特異性、高效等優(yōu)勢。在檢測行業(yè)中已有廣大應(yīng)用。如馮育芳、刑進(jìn)、張雪青等編制的多重PCR檢測動(dòng)物布氏桿菌的方法，具有不需要培養(yǎng)活菌的優(yōu)點(diǎn),極大降低了實(shí)驗(yàn)室感染的風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)可以檢測布氏桿菌的多種型類別,以減少漏檢的發(fā)生，反應(yīng)耗時(shí)1小時(shí)57分鐘；孫明、劉巧榮、宋文靜等利用快速實(shí)時(shí)熒光PCR檢測犬布氏桿菌，反應(yīng)耗時(shí)2小時(shí)；李軻、郭華麟、禹建鷹等建立了多重IMS-熒光RPA方法檢測布氏桿菌，能在三小時(shí)內(nèi)檢測出布氏桿菌，且靈敏性、特異性、重復(fù)性都符合要求[17-19]。本研究成功建立了重組酶介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增檢測布氏桿菌的新方法。本方法擴(kuò)增溫度為39℃，擴(kuò)增時(shí)間為20分鐘，最低可檢測到100拷貝數(shù)的布氏桿菌樣品，且該方法特異性高。相對于其他PCR方法，本方法不需要使用復(fù)雜的儀器和精良實(shí)驗(yàn)室，只需要一臺恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀。操作簡便的同時(shí)，該方法反應(yīng)耗時(shí)短，只需15-20分鐘