正交設計法優(yōu)化護肝片制備五味子乙素的工藝

正交設計法優(yōu)化護肝片制備五味子乙素的工藝

五味子是“神農本草經”中最古老的。它是木蘭科植物五味子的干燥成熟果實。它是中醫(yī)的主要成分之一。它具有收斂、收斂、益氣、補液、補腎、寧心的功效。用于長期咳嗽、哮喘、夢境中的滑精、尿頻、長期腹瀉、自發(fā)出汗、出汗、出汗、口渴、虛弱、脈搏不足、發(fā)燒、口渴、心悸、失眠和其他癥狀。我廠將五味子用乙醇提取后,制成護肝片,護肝片具有疏肝理氣、健脾消食,降低血清谷丙轉氨酶的作用,對慢性、病毒性肝炎、遷延性肝炎、早期肝硬化具有顯著療效。但其中五味子的主要有效成份五味子乙素存在于種子中,常與大量樹脂狀物共存,在一般制備過程中不易被提出,給工業(yè)生產造成很大困難,同時也浪費了大量五味子藥材。為此,我們本著為工業(yè)生產降低成本,提高護肝片劑中五味子乙素含量,縮短生產周期,通過正交試驗的方法得出一種比較理想的五味子提取工藝,適用于工業(yè)化大生產。2材料和方法2.1設備和材料2.1.1譜站面向更加廣泛的部門,開發(fā)譜站-vp6.12版日本島津LC-2010C型高效液相色譜儀,島津色譜工作站CLASS-VP6.12版。AB204-N電子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司),電熱小型三用水箱(北京醫(yī)療設備廠),真空干燥箱。2.1.2藥料、試劑和儀器樣品五味子(哈藥集團制藥四廠)。對照品五味子乙素(由中國藥品生物制品檢定所提供,批號為0765-20003,供含量檢測用)試劑硅藻土、甲醇、正己烷、乙醇(均為分析純)。2.2方法2.2.1藥代動力學測定五味子乙素含量的正交試驗以乙醇溶液為提取介質,選取提取劑濃度、提取時間、提取次數、溶劑用量為主要考察的主要因素,采取回流提取方式,以測得的五味子乙素含量為考察指標進行4因素3水平L9(34)正交試驗,試驗因素水平見表1。2.2.2l934正交試驗本試驗選擇L9(34)正交表,具體實施方案見表2。2.2.3五味子含量測定2.2.3.流動相、檢測波長色譜柱:Shim-packVP-ODS(4.6mm*120nm,5?);流動相:甲醇-水(78:22);流速:1.0ml/min,檢測波長:254nm;進樣量:供試液、對照液均勻為20μl;柱溫為室溫。2.2.3.d倍量a溶液的提取將北五味子干燥后粉碎成粗粉,稱取9份,每份20g,置于100ml圓底燒瓶中,按表2規(guī)定的條件加入D倍量A濃度的乙醇,在沸水浴中提取C次,每次B時間,離心(4000r/min,30min),上清液濃縮并回收乙醇,合并濃縮液,定容到100ml容量瓶中,得提取液。2.2.3.對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的五味子乙素對照品10mg,置于50ml的容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得對照品溶液。(每1ml含五味子乙素0.2mg)2.2.3.標準曲線的繪制精密吸取五味子乙素對照液2、4、6、8、10ml于10ml容量瓶中,加甲醇定容,在上述色譜條件下進樣20μl測定,以進樣量為橫坐標,峰面積積分值為縱坐標,作出標準曲線如下,見圖1。結果其回歸方程為:Y=5.029×104+3.543×105Xr=0.99905(n=5)表明五味子乙素在0.4～2.0μg范圍內呈良好的線性關系。2.2.3.供試品溶液的制備分別吸取15ml提取液,加入硅藻土6.0g,拌勻于蒸發(fā)皿中水浴蒸干,以正己烷150ml于索氏提取器中回流6h,蒸干溶劑,用甲醇溶解并定容到10ml容量瓶中,搖勻,用微孔濾膜(0.45μm)過濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液。2.2.3.高效液相色譜法在上述色譜條件下,分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液20μl,注入高效液相色譜儀,測定,測定峰面積,外標法計算,即得。對照品及樣品的高效液相色譜圖見圖2、圖3。2.2.3.加樣回收率試驗精密稱取已知含量的五味子粗粉2.5g,精密稱定,共取5份,各加入定量的五味子乙素對照品溶液0.106mg,按樣品液、供試品溶液的制備方法制備試液,按測定法測定各樣品中五味子乙素含量,計算回收率,結果見表3。3結果與討論3.1結果五味子乙素含量測定結果見表3。3.2乙醇最佳提取工藝的確定將正交表中數據進行統(tǒng)計處理,結果見正交表(表2)。由正交表SSj值可知SSA、SSB、SSC較大,而SSD=0.0565最小,按常規(guī)處理方法,平均值當作SSe,將正交試驗結果進行方差分析,結果見表4。由方差分析表可知,對收率影響因素依次為A﹥B﹥C,即最大影響因素為乙醇濃度,其次是提取時間、提取次數;因素A(乙醇濃度)對五味子乙素含量高顯著影響(P<0.01),因素B(提取時間)、因素C(提取次數)對五味子乙素含量有明顯影響(P<0.05)。由實驗結果可知,乙醇的最佳濃度為85%;提取時間越長,提取效果越好,但提取時間長消耗的能量增加,加大了生產成本,且效果增加幅度不大,考慮到工業(yè)生產中節(jié)約能源、省時,綜合成本與效果,定提取時間為3小時;提取次數越多,提取越完全,但提取次數越多乙醇和能量的消耗量就越大,故結合實際,提取次數定為2次;溶劑用量的增加,提取遞度越大,提取效果越好,故溶劑用量定為4倍。根據研究結果,綜合考慮各種因素,由正交試驗結果結合生產實際,確定最佳工藝條件為A2B2C3D1,即使用4倍量的85%的乙醇提取2次,每次3小時為最佳提取工藝條件。查表知:F0.95(2,2)=19.00F0.99(2,2)=99.003.3s1b2c3-乙醇最佳提取條件的確定為驗證由正交試驗優(yōu)選而得的最佳工藝A2B2C3D1(即使用4倍量85%的乙醇提取2次,每次3小時)組合的正確性,按此組合做5次平行實驗,實驗結果見表5,五味子乙素的平均含量為3.8923%。試驗表明A2B2C3D1提取效果高,為最佳條件,且提取效果穩(wěn)定。即五味子提取的最佳工藝條件為使用4倍量的85%的乙醇提取2次,每次3小時。該工藝是穩(wěn)定可行的,適合于工業(yè)生產。3.4采收季節(jié)對藥材品質的影響3.4.1五味子中木脂素成份屬聯(lián)苯環(huán)辛烯型木脂素,在植物體內常與大量樹脂狀物共存,本身在溶劑處理過程中容易樹脂化。這是提取過程中的難點,而且溶劑不易滲透到植物細胞,五味子又是植物的果實藥材,很難提取完全和提取出來。3.4.2通過對不同來源的多批北五味子種子中乙素成份HPLC分析及含量測定,結果顯示同一品種不同來源的北五味子藥材,其五味子乙素成份有較大差異,因此,北五味子藥材的品質與藥源有很大的關系。此外采收季節(jié)對藥材品質的影響也是很重要的一個方面。3.4.3北五味子種子的粉碎與否能顯著影響提取效率,原因是粉碎能使種子的種皮破裂,有利于溶劑的滲透及有效成分的溶出,因此提取時應以粗粉為佳。3.4.4由于2000版中國藥典沒有規(guī)定五味子提取方法,而原部標和省標的工藝方法都采用75%乙醇回流提取五味子。通過實驗證明,用85%乙醇提取五味子,五味子乙素的含量較高。因為五味子乙素屬脂溶性成份,所以適當提高乙醇的濃度,有利于對五味子乙素的提取。3.4.5五味子乙素結構中含有氧環(huán),長時間加熱回流提取會破壞其有效成份,使其含量降