upa、mmp-9在大鼠矽肺組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究

upa、mmp-9在大鼠矽肺組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究

巖肺是一種廣泛存在于長期二氧化硅灰塵中的全身疾病，主要是肺組織的慢性纖維。尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)在肺炎癥及纖維化的形成中扮演著重要的角色,在矽肺纖維化中可能存在uPA誘導(dǎo)的纖溶系統(tǒng)活化與MMP介導(dǎo)的纖維化通路的交互作用,研究uPA、MMP-9在大鼠矽肺纖維化中的作用機(jī)制可為矽肺的早期診斷、治療提供新的思路。1材料和方法1.1模型分組與試劑Wistar大鼠60只,體質(zhì)量為180~220g。由山東大學(xué)動物實驗中心提供,許可證號:SCXK(魯)2005-0015。隨機(jī)分為模型組與對照組,每組30只。二氧化硅(SiO２)由威佳科技有限公司提供(美國Sigma公司),配制成50mg/ml的矽塵混懸液。兔抗大鼠uPA多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司,工作濃度為1∶50;兔抗人MMP-9由美國SantaCruz公司提供,工作濃度為1∶60;SP免疫組化試劑盒為北京中山生物技術(shù)有限公司提供,為即用型。1.2免疫組化顯色模型1.2.1動物模型的建立0.4%戊巴比妥麻醉大鼠,仰臥位固定,頸部消毒,暴露氣管,將1ml矽塵混懸液緩慢注入氣管后,立即將動物直立并旋轉(zhuǎn),使液體在左右兩肺均勻分布。同法對照組大鼠氣管內(nèi)注入1ml滅菌生理鹽水。模型建立后,每組分別在第1、第3、第7、第21、第28天取5只大鼠處死。取出肺組織用10%甲醛固定,脫水石蠟包埋。經(jīng)HE染色顯示,正常肺組織結(jié)構(gòu)大部遭到破壞;結(jié)節(jié)主要由吞噬矽塵顆粒的泡沫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及上皮樣細(xì)胞組成,則表明模型成功［１］。1.2.3結(jié)果判定免疫結(jié)果半定量判斷參照免疫組化顯色標(biāo)準(zhǔn)略修改［２］:按顯色程度分弱、中、強(qiáng)3種,分別用+、++、+++表示。每個標(biāo)本每個指標(biāo),取5個較好的高倍視野,按顯色范圍分為:(1)+為顯色范圍占高倍視野<1/4;(2)++為顯色占高倍視野1/4~2/4;(3)+++為顯色占高倍視野2/4~3/4。并將每個高倍視野顯色程度和范圍換算成“顯色指數(shù)”,顯色指數(shù)=顯色程度×顯色范圍(+為1、++為2、+++為3),取其均數(shù)為每個檢測指標(biāo)的最終顯色指數(shù)。1.3均數(shù)轉(zhuǎn)換方差齊用SPSS11.0統(tǒng)計軟件,計量資料的均數(shù)比較以ue0af±s表示(方差齊);方差不齊者將數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換后以ue0af±s表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1肉芽腫的分離純化對照組各時間點肺組織結(jié)構(gòu)基本正常,炎癥反應(yīng)輕微,支氣管周圍淋巴細(xì)胞反應(yīng)性增生。由圖1可見,染矽塵組,注入矽塵后第3天,巨噬細(xì)胞在肺泡腔內(nèi)聚集,肉芽腫結(jié)節(jié)開始在肺泡腔內(nèi)形成;第7天,小肉芽腫彌漫存在,并融合成較大的肉芽腫;第14天,肉芽腫進(jìn)行性纖維化,成纖維細(xì)胞增生并平行排列,可見巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞及反應(yīng)性肺氣腫;第28天,可見巨大纖維性結(jié)節(jié),纖維化損害進(jìn)一步擴(kuò)大,甚至占滿整個肺葉,正常肺組織結(jié)構(gòu)大部分遭到破壞。2.2染塵時間和時間對upa蛋白表達(dá)的影響對照組肺組織可見uPA、MMP-9蛋白表達(dá),主要分布在肺泡上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞中,陽性反應(yīng)物質(zhì)呈棕黃色,細(xì)胞質(zhì)著色,但表達(dá)強(qiáng)度均較弱。由圖2可見,染塵組uPA的陽性表達(dá)明顯增多,且隨染塵時間的延長,uPA蛋白表達(dá)呈增強(qiáng)趨勢,至第1周時達(dá)高峰,主要分布在中性粒細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞中;此后逐漸減少,但在第4周時仍較對照組明顯,以肺組織結(jié)節(jié)內(nèi)陽性表達(dá)為主,染塵各組蛋白表達(dá)與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MMP-9蛋白陽性表達(dá)較對照組明顯增多,且隨染塵時間的延長,表達(dá)強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng),至第1周達(dá)高峰,此后呈減弱趨勢,染塵第4周時染色陽性細(xì)胞較第1周時明顯減少,但仍明顯高于正常肺組織。染塵各組MMP-9蛋白表達(dá)與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2.3染塵組mmp-9的表達(dá)特點隨著染塵時間的延長,uPA蛋白陽性表達(dá)明顯增多,至第1周時達(dá)高峰,此后逐漸減少,但在第4周時仍多于對照組,以肺組織結(jié)節(jié)內(nèi)陽性表達(dá)為主,染塵各組其蛋白表達(dá)顯色指數(shù)與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由表1可見,染塵組從第1天起即可見MMP-9在中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞中的表達(dá),隨著染塵時間延長,其陽性表達(dá)逐漸增強(qiáng),至第7天時最強(qiáng),此后呈減弱趨勢,染塵第4周時染色陽性細(xì)胞較第1周時明顯減少,但仍明顯高于正常肺組織。染塵各組其蛋白表達(dá)顯色指數(shù)與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。將染塵組uPA、MMP-9陽性表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)隨著染矽塵時間的延長,uPA、MMP-9陽性表達(dá)均增強(qiáng),二者呈正相關(guān)(P=0.009<0.01)。3upa活性的變化肺纖維化是肺組織對損傷的修復(fù)反應(yīng),我們采用矽塵氣管內(nèi)染毒誘導(dǎo)大鼠肺纖維化形成,HE染色發(fā)現(xiàn),第3天時,巨噬細(xì)胞在肺泡腔內(nèi)聚集,肉芽腫開始形成;第1周時小肉芽腫彌漫存在,并融合成較大的肉芽腫;第2周肉芽腫呈進(jìn)行性纖維化;進(jìn)入第4周,可見纖維性結(jié)節(jié),纖維化損害進(jìn)一步擴(kuò)大,正常肺組織結(jié)構(gòu)大部遭到破壞。與文獻(xiàn)報道早期2周左右時以肺泡炎癥為主、后期4周左右主要表現(xiàn)為纖維化相一致［３］。uPA是纖溶酶原激活物(PA)的一種存在形式,uPA具有高度特異性激活纖溶酶原為纖溶酶的活性,與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(ECM)的降解有關(guān)［４］。本實驗結(jié)果顯示,染塵組uPA的陽性表達(dá)較對照組明顯增多,至第1周時達(dá)高峰,主要分布在中性粒細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞中;此后逐漸減少,但在第4周時仍較對照組明顯,以肺組織結(jié)節(jié)內(nèi)陽性表達(dá)為主。其機(jī)制可能是在纖維化早期階段,uPA蛋白表達(dá)升高有利于降解ECM,到了后期階段,其他因素參與抵消了由uPA升高引起的基質(zhì)降解,從而使ECM增多,促進(jìn)了纖維化的發(fā)展［５－７］。MMP-9是參與肺纖維化的主要酶類,通過分解IV型膠原蛋白及糖蛋白成分使肺基底膜成分降解,破壞肺泡壁結(jié)構(gòu)的完整性,從而有利于成纖維細(xì)胞遷移到肺泡腔,造成肺泡腔內(nèi)纖維化。本實驗顯示,染塵早期肺組織內(nèi)MMP-9蛋白表達(dá)明顯增加,而該酶活力的增加可降解、破壞基膜,刺激肌纖維母細(xì)胞與上皮細(xì)胞等ECM生成細(xì)胞的活化,引起肺泡纖維化［８］。模型組后期MMP-9活力有所下降,膠質(zhì)纖維化形成明顯,說明隨ECM生成細(xì)胞的進(jìn)一步活化,膠原等基質(zhì)生成增加,降解減少,最終導(dǎo)致肺泡與間質(zhì)的ECM過度增生與異常沉積,即肺纖維化。同時說明,MMP-9活力在肺纖維化的不同階段其變化特點并不一致,從而導(dǎo)致肺組織重構(gòu)纖維化。研究顯示,uPA基因敲除可以激活基質(zhì)金屬蛋白酶,uPA及其下游的纖溶酶系統(tǒng)是調(diào)節(jié)MMP-9活力和降解ECM的關(guān)鍵因素,由uPA、纖溶酶及MMP-9構(gòu)成的級聯(lián)激活反應(yīng)是調(diào)節(jié)ECM沉積的主要途徑,uPA活性的改變會直接影響纖維化進(jìn)程［９］。本研究顯示,uPA和MMP-9在大鼠矽肺組織的主要細(xì)胞中表達(dá)均有所增強(qiáng)(尤其在矽塵刺激后的第3~第14天),其顯色指數(shù)變化基本同步,且存在正相關(guān)。表明在肺巨噬細(xì)胞和肺間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)MMP-9的表達(dá)可能是由uPA介導(dǎo)。因此,可能存在一個uPA誘導(dǎo)的纖溶系統(tǒng)的活化與MMP-9介導(dǎo)的通路交互作用網(wǎng)絡(luò),uPA系統(tǒng)通過控制內(nèi)