慢性應激抑郁型黃褐斑多因素模型的建立與驗證

慢性應激抑郁型黃褐斑多因素模型的建立與驗證

黃褐斑是臨床上常見的疾病之一。近年來，國內外科學家對黃褐斑的治療取得了一些進展，為黃褐斑的治療提供了新的機會。但激光照射對人表皮黑素細胞生物學的影響卻并不十分清楚?；A研究顯得尤為重要,使得黃褐斑的動物模型的研究成為非常重要的課題。查閱以往關于黃褐斑的動物模型研究文獻,國內外均有報道,主要以小鼠局部紫外光照射、內用雌激素全身攻擊、微量定點注射輔以紫外線照射等方法進行造模,由于黃褐斑是多因素致病機理而產(chǎn)生,單一因素造模法建立的動物模型代表性比較差。綜合其諸多因素的考慮,筆者通過紫外線照射、雌激素全身攻擊、慢性輕度不可預見的應激刺激建立黃褐斑實驗動物模型。1材料和方法1.1材料表面1.1.1分組、分組:實驗動物中心在中國5月5日起球/10健康純白色雌性豚鼠60只,清潔級,體質量(280±12)g,隨機分為5組,每組12只,由深圳市人民醫(yī)院實驗動物中心提供。1.1.2蛋白質基因型檢測試劑盒黃體酮注射液1ml:20mg(上海通用藥業(yè)股份有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、酪氨酸(Tyr)檢測試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);HMB45(melanoma黑素瘤)鼠抗人單克隆抗體即用型試劑盒(福建邁新公司);中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司)。1.1.3中波紫外線uvb的皮膚組紫外線照射燈(UVB,德國Waldmann);UV2401PC紫外分光光度計(日本島津公司);CMIAS多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)2000型(空軍總醫(yī)院與北京航空航天大學共同研制)。1.2動物造模方法:造模時間28天。(1)空白組:以10%NaS2水溶液背部脫毛,每周脫毛一次,背部裸露約2.0cm×2.0cm面積皮膚1塊;每天肌肉注射注射用水,5ml/kg體質量;(2)紫外線組:同正常組脫毛處理,每日以波長為320nm的中波紫外線(UVB)照射豚鼠背部皮膚1次,照射時間30min,動物與光源的距離為20cm;(3)黃體酮組:同正常組脫毛處理,每日8:00~9:00交替于豚鼠兩后腿肌肉注射0.4%黃體酮,5ml/kg體質量;(4)紫外線+黃體酮組:同正常組脫毛處理,紫外線照射方法和黃體酮注射方法同紫外線組和黃體酮組;(5)紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組:同正常組脫毛處理,紫外線照射方法和黃體酮注射方法同紫外線組和黃體酮組。同時進行慢性輕度不可預見性的應激抑郁豚鼠模型方案:按照文獻并略加改進,將明暗顛倒24h、2h行為限制、停食24h、停水24h、夾尾1min、40℃水中游泳5min、電擊足底5s(30伏電壓)、搖晃5min(160HZ)、40℃環(huán)境5min共9種刺激隨機安排到28日內,每日1種,每種刺激出現(xiàn)2次,使動物不能預料刺激的發(fā)生,同種刺激不能重復出現(xiàn)。1.3指標和方法的測量1.3.1小鼠血清中蘇氏原激素的表達取豚鼠明顯的色變去毛皮膚1塊(0.2cm×0.2cm),10%福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋切片。再經(jīng)脫蠟至水化、抗原修復后,用HMB45(melanoma黑素瘤)為第一抗體,DAB顯色,蘇木素復染。用PBS代替一抗做陰性對照。1.3.2彩色圖像采集采用病理圖像分析系統(tǒng)對目標圖像進行定量分析,隨機選擇每張切片在顯微鏡物鏡400X下5個不重疊視野進行彩色圖像采集與存儲,計算出每個視野中的目標個數(shù)、陽性目標面積、平均灰度值與平均光密度值等。1.3.3細胞粉碎機勻漿切取脫毛部位皮膚0.2g,用預冷生理鹽水(4℃)沖洗,除盡雜質,拭干,分別放入有2.0ml預冷生理鹽水的小試管內,用細胞粉碎機勻漿4次,每次5s。勻漿后以3500r/min離心15min,取上清液采用試劑盒檢測MDA、SOD及酪氨酸活性。1.4行為實驗方法1.4.1建立條件試驗觀察敞箱裝置由不透明材料制成,底面為76cm×76cm的正方形并被等分為25個等邊方格,周圍有高42cm的圍墻。于第29天7:30~12:00之間在安靜的房間內進行此項試驗觀察。將豚鼠置于中心方格內,觀察豚鼠在5min內中央格停留時間、穿越格數(shù)(四爪均進入的方格方可記數(shù),為水平運動得分)、后肢直立次數(shù)(兩前爪騰空或攀附墻壁,為垂直運動得分),徹底清潔敞箱后再進行下一只豚鼠的觀察。實驗要求在單盲的條件下進行,減少人為的誤差。觀察指標:豚鼠穿格次數(shù)、理毛時間和次數(shù)、直立次數(shù)。反復進行4次,每次間隔3min。取后3次的數(shù)據(jù)計算平均數(shù)用于統(tǒng)計處理。1.4.2鼠尾點采用x射線衍射法測定鼠尾的時間用一塊軟布輕輕裹住實驗豚鼠的身軀僅露出尾巴,使之不能逃脫但不能過于束縛。將鼠尾尖端約1.5cm部分浸入53℃的水浴內,同時用秒表測出鼠尾從浸入到甩出水面的時間(精確到0.1s)。連續(xù)做4次,每次間隔30s。統(tǒng)計取后3次的數(shù)據(jù)計算平均數(shù)。1.4.3動物基礎營養(yǎng)成分測定實驗第25天在隔噪音、安靜的房間內,訓練動物適應含糖飲水,每籠同時放置2個水瓶,第一個24h,兩瓶均裝有1%蔗糖水,隨后的24h,一個瓶裝1%蔗糖水,一個瓶裝純水。第27天23h的禁食禁水,第28天進行動物的基礎糖水/純水消耗試驗,同時給予每只豚鼠定量好的兩瓶水:一瓶1%蔗糖水,一瓶純水。24h后取走兩瓶并稱重。第29天計算動物的總液體消耗、糖水消耗、純水消耗、糖水偏愛(糖水偏愛=糖水消耗/總液體消耗×100%)。1.4.4體重減輕觀察不同因素刺激下豚鼠體質量增加的區(qū)別,分別測量每組豚鼠在實驗開始時和第28天試驗結束時的體質量,并進行分析。1.5統(tǒng)計學處理SPSS17.0統(tǒng)計學軟件,數(shù)據(jù)以表示,計量數(shù)據(jù)采用t檢驗。組間差異的顯著性檢驗運用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1小鼠皮膚長期毒性試驗結果紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組造模動物1周后出現(xiàn)精神差、反應遲鈍、進食減少、體重下降、毛發(fā)易脫落、小便量增多。兩周后紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組較其他組上述癥狀明顯加重,相比空白組豚鼠精神好、反應敏捷、毛發(fā)濃密有光澤、飲食、大小便正常。除空白對照組以外,其余四組第28天,背部皮膚色素沉著加深,呈灰褐色。紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組較其他組明顯。2.2皮膚表皮基底層和高效組織的hma45標記陽性黑素細胞的表征與空白組(圖1A)比較,紫外線組豚鼠皮膚HMB45標記陽性的黑素細胞少量增多,表皮基底細胞和棘細胞層中可見單個散在分布的黑素細胞(圖1B);黃體酮組豚鼠皮膚表皮基底層和棘細胞層中可見散在少量分布的HMB45標記陽性的黑素細胞(圖1C);紫外線+黃體酮組豚鼠皮膚表皮基底層和棘細胞層中可見多個散在分布的HMB45標記陽性的黑素細胞(圖1D);紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組豚鼠皮膚HMB45標記陽性的黑素細胞明顯增多,多個成簇分布于表皮基底細胞和棘細胞層中,呈強陽性反應(圖1E)。2.3黑素目標計算機圖像分析2.3.1紫外線+黃體酮+慢性應激各組豚鼠皮膚黑素細胞的個數(shù)均較空白組有所增加,其中紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組有極顯著性差異(P<0.01)。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組黑素細胞個數(shù)與其他各組有顯著差異,具有統(tǒng)計學意義(F=266.729,P<0.01)。各組數(shù)密度明顯高于空白組,尤其是紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組可見與空白組有極顯著差異(P<0.01)。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組數(shù)密度與其他各組有顯著差異,具有統(tǒng)計學意義(F=84.896,P<0.01)(表1)。2.3.2紫外線+黃體酮和慢性應激抑郁癥患者光密度值對比結果顯示,與空白組比較,其他四組的平均光密度值均較空白組升高,除黃體酮組外平均灰度值較空白組有所下降。其中,紫外線+黃體酮組和紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組豚鼠平均光密度值、平均灰度值有極顯著性差異(P<0.01)。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組平均光密度值、平均灰度值與其他各組有顯著差異,存在統(tǒng)計學意義(F=17.399,P<0.01;F=39.011,P<0.01)(表2)。2.4行為測試2.4.1慢性應激試驗黃體酮+紫外線+應激抑郁組的穿格次數(shù)、直立次數(shù)、理毛時間、理毛次數(shù)均較空白組有所減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其他組與空白組差異性比較均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)提示慢性不可預見性的應激刺激28天后的豚鼠出現(xiàn)了抑郁的現(xiàn)象(表3)。2.4.2統(tǒng)計學意義紫外線+黃體酮組和紫外線+黃體酮+應激抑郁組甩尾時間均較空白組顯著延長,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組甩尾時間與其他各組有顯著差異,具有統(tǒng)計學意義(F=9.469,P<0.01)(表4)。2.4.3計算體重減輕的性能2.5紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組大鼠皮膚sod活性的變化在5組中,紫外線+黃體酮組和紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組模型豚鼠皮膚的MDA水平均較正常組升高,SOD活性較正常組有所下降,有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組豚鼠皮膚MDA、SOD較其他組顯著性差異(F=19.763,P<0.01;F=53.264,P<0.01)。提示此種模型建立對于豚鼠皮膚MDA、SOD的活性影響非常大(表7)。2.6組小鼠血清中點分布表1紫外線+黃體酮組和紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組酪氨酸含量與空白組比較明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組酪氨酸含量較其他各組明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(F=59.552,P<0.01)(表8)。3重復與綜合結果分析普遍認為黃褐斑發(fā)病原因可能與紫外線照射、遺傳因素、情緒變化、內分泌失調、藥物等多種因素密切相關,現(xiàn)階段雖然治療方法較多,但療效較差。因此,進一步客觀研究黃褐斑動物模型在研究黃褐斑的治療機制過程中有著重要的意義。查閱以往文獻黃褐斑動物模型都是從單一的致病機制來建立黃褐斑動物模型,研究結果也只是從一個方面來反映了疾病的表現(xiàn),因此不能綜合全面的表達黃褐斑病因病機。趙廣等調查200例黃褐斑患者研究發(fā)現(xiàn),自覺黃褐斑的發(fā)生和加重與情緒抑郁相關的患者占54.5%。其中有部分患者面部黃褐斑是由于家中突發(fā)的惡性事件所誘發(fā)的。所以黃褐斑動物模型中應該考慮情緒抑郁導致的發(fā)病因素,汪南玥等考慮到黃褐斑的中醫(yī)辨證分型中以肝郁型為多見,采用雌激素全身攻擊、慢性束縛法、局部紫外光照射法建立多因素黃褐斑豚鼠肝郁模型,其豚鼠皮膚黑素細胞和MDA、SOD等客觀指標的變化較其他模型也更加類似人類黃褐斑的病變和表現(xiàn)。目前廣泛應用慢性輕度不可預見的應激來模擬制作抑郁癥動物模型,更類似于人類抑郁癥發(fā)病機理。研究表明抑郁癥的首要促發(fā)因素是長期、低強度的日常應激性生活事件,而且在制作抑郁動物模型中,模型成功的關鍵是應激因素的多變性和不可預測性,并且沒有一種應激因子單獨應用可產(chǎn)生理想效應,反之沒有一種應激因素是抑郁模型成功所必不可少的。所以單一的慢性束縛法造成抑郁,某種程度上很難具備典型抑郁模型的特征,但為筆者制作更加科學的黃褐斑動物模型提供了思路。綜合其諸多因素的考慮,因此建立更加科學的黃褐斑動物模型,不僅僅是病理狀態(tài)上的相似性,還因考慮精神方面的因素。建立多因素黃褐斑動物模型更全面體現(xiàn)黃褐斑的病理機制。皮膚黑色素病理形態(tài)學研究結果與生化指標檢測是判斷黃褐斑的動物模型是否成功最主要指標。而前者是直接、最客觀的指標。光鏡下可見各組間比較紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組黑色素細胞較空白組豚鼠黑素陽性細胞明顯增多,與過偉峰等結果一致。計算機病理圖象學定量分析結果顯示,紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組同其他組比較豚鼠數(shù)密度、平均光密度值、平均灰度值有極顯著性差異,具有統(tǒng)計學意義。其MDA、SOD等生化指標檢測與黃褐斑主要臨床特征類似。說明多重因素造模后較其他單一因素組豚鼠黃褐斑動物模型更加接近人類黃褐斑變病特征,并且具有抑郁癥的行動學表現(xiàn)。該模型的建立為將來探討黃褐斑動物模型提供了基礎和思路,為研究黃褐斑治療方法提供了較為理想的動物模型。在造模的28天中,各組豚鼠的體質量均有所增加。紫外線+黃體酮組和黃體酮+紫外線+應激抑郁模型組較正常組的體質量增加量有所減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應激抑郁組體質量增加量較