慢性應(yīng)激抑郁型黃褐斑多因素模型的建立與驗(yàn)證

慢性應(yīng)激抑郁型黃褐斑多因素模型的建立與驗(yàn)證

黃褐斑是臨床上常見的疾病之一。近年來，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家對(duì)黃褐斑的治療取得了一些進(jìn)展，為黃褐斑的治療提供了新的機(jī)會(huì)。但激光照射對(duì)人表皮黑素細(xì)胞生物學(xué)的影響卻并不十分清楚?；A(chǔ)研究顯得尤為重要,使得黃褐斑的動(dòng)物模型的研究成為非常重要的課題。查閱以往關(guān)于黃褐斑的動(dòng)物模型研究文獻(xiàn),國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道,主要以小鼠局部紫外光照射、內(nèi)用雌激素全身攻擊、微量定點(diǎn)注射輔以紫外線照射等方法進(jìn)行造模,由于黃褐斑是多因素致病機(jī)理而產(chǎn)生,單一因素造模法建立的動(dòng)物模型代表性比較差。綜合其諸多因素的考慮,筆者通過紫外線照射、雌激素全身攻擊、慢性輕度不可預(yù)見的應(yīng)激刺激建立黃褐斑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。1材料和方法1.1材料表面1.1.1分組、分組:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心在中國(guó)5月5日起球/10健康純白色雌性豚鼠60只,清潔級(jí),體質(zhì)量(280±12)g,隨機(jī)分為5組,每組12只,由深圳市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.1.2蛋白質(zhì)基因型檢測(cè)試劑盒黃體酮注射液1ml:20mg(上海通用藥業(yè)股份有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、酪氨酸(Tyr)檢測(cè)試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所);HMB45(melanoma黑素瘤)鼠抗人單克隆抗體即用型試劑盒(福建邁新公司);中性樹膠(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。1.1.3中波紫外線uvb的皮膚組紫外線照射燈(UVB,德國(guó)Waldmann);UV2401PC紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);CMIAS多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)2000型(空軍總醫(yī)院與北京航空航天大學(xué)共同研制)。1.2動(dòng)物造模方法:造模時(shí)間28天。(1)空白組:以10%NaS2水溶液背部脫毛,每周脫毛一次,背部裸露約2.0cm×2.0cm面積皮膚1塊;每天肌肉注射注射用水,5ml/kg體質(zhì)量;(2)紫外線組:同正常組脫毛處理,每日以波長(zhǎng)為320nm的中波紫外線(UVB)照射豚鼠背部皮膚1次,照射時(shí)間30min,動(dòng)物與光源的距離為20cm;(3)黃體酮組:同正常組脫毛處理,每日8:00~9:00交替于豚鼠兩后腿肌肉注射0.4%黃體酮,5ml/kg體質(zhì)量;(4)紫外線+黃體酮組:同正常組脫毛處理,紫外線照射方法和黃體酮注射方法同紫外線組和黃體酮組;(5)紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組:同正常組脫毛處理,紫外線照射方法和黃體酮注射方法同紫外線組和黃體酮組。同時(shí)進(jìn)行慢性輕度不可預(yù)見性的應(yīng)激抑郁豚鼠模型方案:按照文獻(xiàn)并略加改進(jìn),將明暗顛倒24h、2h行為限制、停食24h、停水24h、夾尾1min、40℃水中游泳5min、電擊足底5s(30伏電壓)、搖晃5min(160HZ)、40℃環(huán)境5min共9種刺激隨機(jī)安排到28日內(nèi),每日1種,每種刺激出現(xiàn)2次,使動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生,同種刺激不能重復(fù)出現(xiàn)。1.3指標(biāo)和方法的測(cè)量1.3.1小鼠血清中蘇氏原激素的表達(dá)取豚鼠明顯的色變?nèi)ッつw1塊(0.2cm×0.2cm),10%福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋切片。再經(jīng)脫蠟至水化、抗原修復(fù)后,用HMB45(melanoma黑素瘤)為第一抗體,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。1.3.2彩色圖像采集采用病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)圖像進(jìn)行定量分析,隨機(jī)選擇每張切片在顯微鏡物鏡400X下5個(gè)不重疊視野進(jìn)行彩色圖像采集與存儲(chǔ),計(jì)算出每個(gè)視野中的目標(biāo)個(gè)數(shù)、陽性目標(biāo)面積、平均灰度值與平均光密度值等。1.3.3細(xì)胞粉碎機(jī)勻漿切取脫毛部位皮膚0.2g,用預(yù)冷生理鹽水(4℃)沖洗,除盡雜質(zhì),拭干,分別放入有2.0ml預(yù)冷生理鹽水的小試管內(nèi),用細(xì)胞粉碎機(jī)勻漿4次,每次5s。勻漿后以3500r/min離心15min,取上清液采用試劑盒檢測(cè)MDA、SOD及酪氨酸活性。1.4行為實(shí)驗(yàn)方法1.4.1建立條件試驗(yàn)觀察敞箱裝置由不透明材料制成,底面為76cm×76cm的正方形并被等分為25個(gè)等邊方格,周圍有高42cm的圍墻。于第29天7:30~12:00之間在安靜的房間內(nèi)進(jìn)行此項(xiàng)試驗(yàn)觀察。將豚鼠置于中心方格內(nèi),觀察豚鼠在5min內(nèi)中央格停留時(shí)間、穿越格數(shù)(四爪均進(jìn)入的方格方可記數(shù),為水平運(yùn)動(dòng)得分)、后肢直立次數(shù)(兩前爪騰空或攀附墻壁,為垂直運(yùn)動(dòng)得分),徹底清潔敞箱后再進(jìn)行下一只豚鼠的觀察。實(shí)驗(yàn)要求在單盲的條件下進(jìn)行,減少人為的誤差。觀察指標(biāo):豚鼠穿格次數(shù)、理毛時(shí)間和次數(shù)、直立次數(shù)。反復(fù)進(jìn)行4次,每次間隔3min。取后3次的數(shù)據(jù)計(jì)算平均數(shù)用于統(tǒng)計(jì)處理。1.4.2鼠尾點(diǎn)采用x射線衍射法測(cè)定鼠尾的時(shí)間用一塊軟布輕輕裹住實(shí)驗(yàn)豚鼠的身軀僅露出尾巴,使之不能逃脫但不能過于束縛。將鼠尾尖端約1.5cm部分浸入53℃的水浴內(nèi),同時(shí)用秒表測(cè)出鼠尾從浸入到甩出水面的時(shí)間(精確到0.1s)。連續(xù)做4次,每次間隔30s。統(tǒng)計(jì)取后3次的數(shù)據(jù)計(jì)算平均數(shù)。1.4.3動(dòng)物基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定實(shí)驗(yàn)第25天在隔噪音、安靜的房間內(nèi),訓(xùn)練動(dòng)物適應(yīng)含糖飲水,每籠同時(shí)放置2個(gè)水瓶,第一個(gè)24h,兩瓶均裝有1%蔗糖水,隨后的24h,一個(gè)瓶裝1%蔗糖水,一個(gè)瓶裝純水。第27天23h的禁食禁水,第28天進(jìn)行動(dòng)物的基礎(chǔ)糖水/純水消耗試驗(yàn),同時(shí)給予每只豚鼠定量好的兩瓶水:一瓶1%蔗糖水,一瓶純水。24h后取走兩瓶并稱重。第29天計(jì)算動(dòng)物的總液體消耗、糖水消耗、純水消耗、糖水偏愛(糖水偏愛=糖水消耗/總液體消耗×100%)。1.4.4體重減輕觀察不同因素刺激下豚鼠體質(zhì)量增加的區(qū)別,分別測(cè)量每組豚鼠在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)和第28天試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的體質(zhì)量,并進(jìn)行分析。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,數(shù)據(jù)以表示,計(jì)量數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)。組間差異的顯著性檢驗(yàn)運(yùn)用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1小鼠皮膚長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)結(jié)果紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組造模動(dòng)物1周后出現(xiàn)精神差、反應(yīng)遲鈍、進(jìn)食減少、體重下降、毛發(fā)易脫落、小便量增多。兩周后紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組較其他組上述癥狀明顯加重,相比空白組豚鼠精神好、反應(yīng)敏捷、毛發(fā)濃密有光澤、飲食、大小便正常。除空白對(duì)照組以外,其余四組第28天,背部皮膚色素沉著加深,呈灰褐色。紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組較其他組明顯。2.2皮膚表皮基底層和高效組織的hma45標(biāo)記陽性黑素細(xì)胞的表征與空白組(圖1A)比較,紫外線組豚鼠皮膚HMB45標(biāo)記陽性的黑素細(xì)胞少量增多,表皮基底細(xì)胞和棘細(xì)胞層中可見單個(gè)散在分布的黑素細(xì)胞(圖1B);黃體酮組豚鼠皮膚表皮基底層和棘細(xì)胞層中可見散在少量分布的HMB45標(biāo)記陽性的黑素細(xì)胞(圖1C);紫外線+黃體酮組豚鼠皮膚表皮基底層和棘細(xì)胞層中可見多個(gè)散在分布的HMB45標(biāo)記陽性的黑素細(xì)胞(圖1D);紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組豚鼠皮膚HMB45標(biāo)記陽性的黑素細(xì)胞明顯增多,多個(gè)成簇分布于表皮基底細(xì)胞和棘細(xì)胞層中,呈強(qiáng)陽性反應(yīng)(圖1E)。2.3黑素目標(biāo)計(jì)算機(jī)圖像分析2.3.1紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激各組豚鼠皮膚黑素細(xì)胞的個(gè)數(shù)均較空白組有所增加,其中紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組有極顯著性差異(P<0.01)。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組黑素細(xì)胞個(gè)數(shù)與其他各組有顯著差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=266.729,P<0.01)。各組數(shù)密度明顯高于空白組,尤其是紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組可見與空白組有極顯著差異(P<0.01)。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組數(shù)密度與其他各組有顯著差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=84.896,P<0.01)(表1)。2.3.2紫外線+黃體酮和慢性應(yīng)激抑郁癥患者光密度值對(duì)比結(jié)果顯示,與空白組比較,其他四組的平均光密度值均較空白組升高,除黃體酮組外平均灰度值較空白組有所下降。其中,紫外線+黃體酮組和紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組豚鼠平均光密度值、平均灰度值有極顯著性差異(P<0.01)。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組平均光密度值、平均灰度值與其他各組有顯著差異,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.399,P<0.01;F=39.011,P<0.01)(表2)。2.4行為測(cè)試2.4.1慢性應(yīng)激試驗(yàn)黃體酮+紫外線+應(yīng)激抑郁組的穿格次數(shù)、直立次數(shù)、理毛時(shí)間、理毛次數(shù)均較空白組有所減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其他組與空白組差異性比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)提示慢性不可預(yù)見性的應(yīng)激刺激28天后的豚鼠出現(xiàn)了抑郁的現(xiàn)象(表3)。2.4.2統(tǒng)計(jì)學(xué)意義紫外線+黃體酮組和紫外線+黃體酮+應(yīng)激抑郁組甩尾時(shí)間均較空白組顯著延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組甩尾時(shí)間與其他各組有顯著差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.469,P<0.01)(表4)。2.4.3計(jì)算體重減輕的性能2.5紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組大鼠皮膚sod活性的變化在5組中,紫外線+黃體酮組和紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組模型豚鼠皮膚的MDA水平均較正常組升高,SOD活性較正常組有所下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組豚鼠皮膚MDA、SOD較其他組顯著性差異(F=19.763,P<0.01;F=53.264,P<0.01)。提示此種模型建立對(duì)于豚鼠皮膚MDA、SOD的活性影響非常大(表7)。2.6組小鼠血清中點(diǎn)分布表1紫外線+黃體酮組和紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組酪氨酸含量與空白組比較明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組酪氨酸含量較其他各組明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=59.552,P<0.01)(表8)。3重復(fù)與綜合結(jié)果分析普遍認(rèn)為黃褐斑發(fā)病原因可能與紫外線照射、遺傳因素、情緒變化、內(nèi)分泌失調(diào)、藥物等多種因素密切相關(guān),現(xiàn)階段雖然治療方法較多,但療效較差。因此,進(jìn)一步客觀研究黃褐斑動(dòng)物模型在研究黃褐斑的治療機(jī)制過程中有著重要的意義。查閱以往文獻(xiàn)黃褐斑動(dòng)物模型都是從單一的致病機(jī)制來建立黃褐斑動(dòng)物模型,研究結(jié)果也只是從一個(gè)方面來反映了疾病的表現(xiàn),因此不能綜合全面的表達(dá)黃褐斑病因病機(jī)。趙廣等調(diào)查200例黃褐斑患者研究發(fā)現(xiàn),自覺黃褐斑的發(fā)生和加重與情緒抑郁相關(guān)的患者占54.5%。其中有部分患者面部黃褐斑是由于家中突發(fā)的惡性事件所誘發(fā)的。所以黃褐斑動(dòng)物模型中應(yīng)該考慮情緒抑郁導(dǎo)致的發(fā)病因素,汪南玥等考慮到黃褐斑的中醫(yī)辨證分型中以肝郁型為多見,采用雌激素全身攻擊、慢性束縛法、局部紫外光照射法建立多因素黃褐斑豚鼠肝郁模型,其豚鼠皮膚黑素細(xì)胞和MDA、SOD等客觀指標(biāo)的變化較其他模型也更加類似人類黃褐斑的病變和表現(xiàn)。目前廣泛應(yīng)用慢性輕度不可預(yù)見的應(yīng)激來模擬制作抑郁癥動(dòng)物模型,更類似于人類抑郁癥發(fā)病機(jī)理。研究表明抑郁癥的首要促發(fā)因素是長(zhǎng)期、低強(qiáng)度的日常應(yīng)激性生活事件,而且在制作抑郁動(dòng)物模型中,模型成功的關(guān)鍵是應(yīng)激因素的多變性和不可預(yù)測(cè)性,并且沒有一種應(yīng)激因子單獨(dú)應(yīng)用可產(chǎn)生理想效應(yīng),反之沒有一種應(yīng)激因素是抑郁模型成功所必不可少的。所以單一的慢性束縛法造成抑郁,某種程度上很難具備典型抑郁模型的特征,但為筆者制作更加科學(xué)的黃褐斑動(dòng)物模型提供了思路。綜合其諸多因素的考慮,因此建立更加科學(xué)的黃褐斑動(dòng)物模型,不僅僅是病理狀態(tài)上的相似性,還因考慮精神方面的因素。建立多因素黃褐斑動(dòng)物模型更全面體現(xiàn)黃褐斑的病理機(jī)制。皮膚黑色素病理形態(tài)學(xué)研究結(jié)果與生化指標(biāo)檢測(cè)是判斷黃褐斑的動(dòng)物模型是否成功最主要指標(biāo)。而前者是直接、最客觀的指標(biāo)。光鏡下可見各組間比較紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組黑色素細(xì)胞較空白組豚鼠黑素陽性細(xì)胞明顯增多,與過偉峰等結(jié)果一致。計(jì)算機(jī)病理圖象學(xué)定量分析結(jié)果顯示,紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組同其他組比較豚鼠數(shù)密度、平均光密度值、平均灰度值有極顯著性差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其MDA、SOD等生化指標(biāo)檢測(cè)與黃褐斑主要臨床特征類似。說明多重因素造模后較其他單一因素組豚鼠黃褐斑動(dòng)物模型更加接近人類黃褐斑變病特征,并且具有抑郁癥的行動(dòng)學(xué)表現(xiàn)。該模型的建立為將來探討黃褐斑動(dòng)物模型提供了基礎(chǔ)和思路,為研究黃褐斑治療方法提供了較為理想的動(dòng)物模型。在造模的28天中,各組豚鼠的體質(zhì)量均有所增加。紫外線+黃體酮組和黃體酮+紫外線+應(yīng)激抑郁模型組較正常組的體質(zhì)量增加量有所減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組體質(zhì)量增加量較