血清型前膠原肽測定肝纖維化的臨床應用

血清型前膠原肽測定肝纖維化的臨床應用

近年來，許多報道認為，血清前膠原（p）p是肝臟鈣化的良好診斷指標。測定方法多采用放射免疫分析法(下稱放免法),所用抗原從動物胎皮中提取。我們曾報道過從人胎皮中提取、純化Ⅲ型前膠原(hPCⅢ)并制備抗血清。本文用125Ⅰ標記純化的hPCⅢ建立放免法,并測定了100例正常人和181例各種肝病和其他病人血清PCⅢ,對肝纖維化的診斷進了臨床評價。材料和方法一、標準曲線繪制放免法測定血清PCⅢ的建立:按改良氯胺T法用125Ⅰ標記純化的hPCⅢ,采用雙抗體PEG法:取100μlhPCⅢ標準或待測血清,加100μl抗hPCⅢ血清后于4℃中放置42～48小時,再加100μl125Ⅰ-hPCⅢ(20000cpm),在4℃中放置6小時,然后加100μl二抗和6%PEG,在室溫中放置30分鐘后離心4000rpm,吸凈上清液,測沉淀物放射活性。在半對數(shù)紙上繪制標準曲線,以B/B0為縱座標,hPCⅢ標準為橫座標。根據(jù)待測標本的B/B0即可查得結(jié)果。對上述方法進行各項質(zhì)量指標檢測(圖省略)。二.臨床病理各分組共測定281例血清PCⅢ,分以下各組:1.正常組:健康輸血員100例;2.急性病毒性肝炎組:我市傳染病醫(yī)院住院病人22例;全系黃疸型;3.慢性遷延性肝炎組18例;4.慢性活動性肝炎組13例;5.肝硬化組76例:其中代償性10例,無黃疸、腹水,無明顯肝功能損害者;失代償性20例,以上兩類肝硬化患者除10例有病理診斷其余均經(jīng)臨床確診,并影象學檢查排除肝占位病變;合并肝癌46例,有33例經(jīng)手術(shù)病理診斷;6.原發(fā)性肝癌(單純型)組22例,11例有手術(shù)病理診斷;7.膽結(jié)石組12例,均經(jīng)手術(shù)證實并取肝活檢;8.其他組共計18例,其中肝海綿狀血管瘤和肝囊腫各3例,肝膿腫1例;非肝病組11例,為慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍、腸炎等患者。結(jié)果一.批間異系數(shù)及回收率125Ⅰ標記hPCⅢ的放化純度93～98%;標準曲線的競爭抑制關(guān)系良好,測定范圍較寬為5～1000μg/L;批內(nèi)和批間變異系數(shù)各為5.2%和6.2%;回收率97.6～102.3%,平均99.2%,靈敏度為6μg/L;hPCⅢ與牛膠原(CⅢ)、人I型膠原(CI)和前膠原(PCI)均無明顯交叉抑制反應,人Ⅰ型前膠原僅在1000μg/L以上有輕度抑制反應,說明此法特異性較高。二、各組小鼠血清pc正常人和各組病人血清PCⅢ測定結(jié)果見表1,分布范圍圖略。正常組平均值為85.0μg/L(單位下略),正常上限為120。肝硬化組血清PCⅢ升高最顯著,其中以合并肝癌組最高,但三組之間統(tǒng)計學上差異不顯著(P>0.05)。慢性活動性肝炎組血清PCⅢ升高顯著,與慢性遷延性肝炎差異顯著(P<0.001);急性肝炎和原發(fā)性肝癌(單純型)略有升高;原發(fā)性肝癌(單純型)肝硬化合并肝癌差異顯著(p<0.001);慢性遷延性肝炎、膽石癥和其他組均無顯著升高。三、無纖維病變者血清pc檢測結(jié)果本文中37例肝活檢標本經(jīng)H-E染色,按纖維化分布范圍和成纖維細胞增生程度分輕、中、重三級,無纖維增生者為O級。其血清PCⅢ測定結(jié)果:O級11例為89.5±18.1;輕級10例為135.5±20.5;中級8例為260.8±39.2;重級8例為369.8±68.0。血清PCⅢ隨著肝纖維化程度加重而遞增,兩者呈密切正相關(guān)(r=0.984,p<0.001)。血清pp及肝纖維化檢測肝纖維化是最常見的肝臟病理改變之一,繼續(xù)發(fā)展可形成肝硬化,進而影響肝實質(zhì)細胞功能,才出現(xiàn)肝功能的異常。因此,一般常規(guī)肝功能試驗無法判斷輕度肝纖維化或早期肝硬化。迄今臨床上主要依靠肝活檢檢查,但其為創(chuàng)傷性方法,且受穿刺部位的局限性,并難以系統(tǒng)動態(tài)觀察。因此,近年來肝纖維化標志物的研究引起了人們高度重視。1979年Rohde氏等首先建立了血清PⅢP放免法,并證實對肝纖維化有臨床診斷意義。此后國外報道日益增多。1988年在瑞士巴塞爾召開的第七屆國際肝病會議上,即有14篇論文集中進行了探討,一致認為血清PⅢP是目前診斷肝纖維化與早期肝硬化最良好的標志物,并與肝纖維化的活動度呈正相關(guān)。國內(nèi)殷蔚荑等采用西德貝林格公司試劑盒測定各類肝病78例血清PⅢP,結(jié)果與國外報告相似。1987年梅長林等從牛胎皮中提取PⅢP,建立放免法測定了133例肝病與13例非肝病,認為血清PⅢP是診斷早期肝硬化有用的標志物。1985年Galambos氏等從山羊胎皮中提純PCⅢ,建立了直接測定PCⅢ的放免法,并將50例病人的血清PCⅢ與肝活檢中纖維化程度進行比較,結(jié)果呈正相關(guān),故認為PCⅢ與PⅢP對肝纖維化有相似的診斷意義。本文用125Ⅰ直接標記hPCⅢ建立了放免法,各項質(zhì)量指標均達到標準要求。用此法測定了181例各種肝病和其他病人血清PCⅢ,肝硬化和慢性活動性肝炎升高最顯著(p<0.001);慢性遷延性肝炎,膽石癥和其他病人組均無顯著升高(p>0.05)。37例肝活檢纖維化程度與血清PCⅢ呈密切正相關(guān)(r=0.984,p<0.001),此與Galambos氏結(jié)果基本一致,以上說明放免法測定PCⅢ對診斷肝纖維化價值是肯定的。大多數(shù)高等動物的膠原基本結(jié)構(gòu)與人類相似,具有部分免疫交叉反應,因此多數(shù)學者從富含膠原的動物胎皮中提?、笮颓澳z原作為免疫測定的抗原。但不同種屬動物之間抗原決定簇有一定差異。如Ⅲ型前膠原α1鏈經(jīng)溴化氰裂解后,在O、I肽片段上人的主要抗原決定簇在2～5位中的亮氨酸上,而牛則在第11位的苯丙氨酸與13位的亮氨酸上。因此抗原取材于人較動物更為特異。1985年Niemela氏等報道從1例胰腺癌伴腹腔廣泛轉(zhuǎn)移的病人腹水中直接提取PⅢP,但取材比較困難。PCⅢ是由細胞內(nèi)合成后分泌至血中,經(jīng)內(nèi)肽酶水解切下的氨基端肽即PⅢP。有些學者認為肝臟發(fā)生炎癥、壞死等病變時,雖然前膠原合成未增加,而分解代謝增加致使血清PⅢP升高。他們證實血清PⅢP與肝臟的炎癥、壞死程度呈正相關(guān),而與肝纖維化的程度相關(guān)性較小,甚至無相關(guān),因此對血清PⅢP診斷肝纖維化提出異義,此為目前爭論的主要問題。有的文獻報道在急性肝炎病人血清中