現(xiàn)階段開(kāi)展的病理實(shí)驗(yàn)

現(xiàn)階段開(kāi)展的病理實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容：免疫組化HE染色幾種特殊的染色原位雜交熒光原位雜交1整理課件

免疫組化1、免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反響使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)。2、我們現(xiàn)階段主要要做的組織免疫組化有石蠟切片、冰凍切片免疫組化以及熒光免疫組化。細(xì)胞免疫組化有細(xì)胞爬片、細(xì)胞印片和細(xì)胞涂片免疫組化和熒光免疫組化。3、免疫組化過(guò)程中抗原修復(fù)有高壓修復(fù)法、酶修復(fù)、微波修復(fù)，其中微波修復(fù)抗原對(duì)提高免疫組化陽(yáng)性檢出率非常有效。4、高壓修復(fù)和微波修復(fù)法中常用的緩沖液有0.01M檸檬酸緩沖液、1mM的EDTA〔pH8.0〕。2整理課件6、酶標(biāo)抗體系統(tǒng)中的酶與顯色劑、復(fù)染液的合理選用：〔1〕辣根過(guò)氧化物酶系統(tǒng)〔HRP〕顯色劑一般用DAB、AEC,DAB顯色液一般染色部位為棕黃色，AEC顯色液一般染色部位為紅色；而HRP系統(tǒng)常用的復(fù)染液為蘇木素，將細(xì)胞核染成藍(lán)色?！?〕堿性磷酸酶系統(tǒng)〔AP〕顯色劑一般用BCIP/NBT、固紅、固藍(lán)。最常用的是BCIP/NBT顯色液，染色部位為深藍(lán)色或者藍(lán)紫色；該系統(tǒng)常用的復(fù)染液為核固紅，將細(xì)胞核染成紅色。3整理課件

免疫組化切片組織前期處理1、組織塊大小應(yīng)限于2cm×1.5cm×0.2cm。2、應(yīng)用于光鏡的免疫組織化學(xué)染色的切片厚度一般要求5μm左右，神經(jīng)組織的研究要求切片厚度在20-100μm，有利于追蹤神經(jīng)纖維的走行。3、石蠟切片為常規(guī)制片技術(shù)，切片厚度2～7μm，應(yīng)用范圍廣，不影響抗體的穿透性，染色均勻一致。4、組織的固定：4%多聚甲醛固定一般1-2小時(shí)。固定后經(jīng)充分的流水沖洗后進(jìn)行脫水包埋。5、組織脫水：主要用不同梯度的酒精進(jìn)行脫水。一般情況下，組織經(jīng)過(guò)70％，80％，90％，95％，以至無(wú)水酒精的脫水程序，即可到達(dá)脫水的要求。但是為了能使大量的組織塊同時(shí)進(jìn)行脫水，那么要求保持液體的濃度以保證脫水的作用，最好是以兩次95％酒精，兩次100％酒精重復(fù)進(jìn)行脫水，以保證組織的水分脫凈。6、組織透明：我們一般采用二甲苯透明，30-60min即可。4整理課件5、石蠟切片：浸蠟、包埋過(guò)程中，石蠟應(yīng)保持在60℃以下，以熔點(diǎn)低的軟蠟較好,浸蠟時(shí)間1－4小時(shí)。6、冰凍切片：組織采用液氮法包埋。將未固定的組織放入OCT包埋劑中對(duì)組織進(jìn)行液氮包埋，包埋后放在-80度冰箱中貯存或者對(duì)其進(jìn)行切片?；蛘邔⒔M織置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高滲吸收組織中水分，減少組織含水量，再放入OCT包埋劑中進(jìn)行包埋。

7、切片的固定：冰凍切片、細(xì)胞切片常用固定液為4℃丙酮或者4%多聚甲醛，固定10-30min。5整理課件

石蠟切片免疫組化1、石蠟切片脫蠟至水。2、3%H2O2室溫孵育5-10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，水洗，5min×3次。3、根據(jù)客戶抗體要求進(jìn)行修復(fù)，PBS沖洗，2min×3次。4、5-10%正常山羊血清封閉〔5%BSA封閉20-30min〕，室溫孵育20-30min。傾去血清，勿洗。5、滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液〔PBS配制〕，37℃孵育1-2小時(shí)或4℃過(guò)夜?！彩覝?0-30min，再放于37℃孵育20-30min〕6、PBS沖洗，2min×3次。7、滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育10-30min。8、PBS沖洗，2min×3次。9、滴加即用型SABC，37℃孵育10-30minPBS沖洗，5min×4次。10、顯色劑顯色〔DAB或AEC〕。11、自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染〔蘇木素〕，脫水透明，封片。返回

B6整理課件石蠟切片免疫組化DAB顯色7整理課件

血涂片，細(xì)胞，冰凍切片免疫組化1、冰凍切片4-8μm，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲(chǔ)存低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后儲(chǔ)存于-20℃冰箱。2、室溫放置30min后，放入4℃丙酮或者4%多聚甲醛固定10-30min。PBS沖洗5min×3次。3、30%過(guò)氧化氫1份+純甲醇50份混合，室溫浸泡30min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。蒸餾水洗2次。4、其余步驟和石蠟切片免疫組化4-11步相同。注：如果冰凍切片直接染色結(jié)果不理想時(shí)，可以參照石蠟切片對(duì)切片進(jìn)行熱修復(fù)，方法和石蠟切片3-11步相同。8整理課件

石蠟切片熒光免疫組化1、石蠟切片脫蠟至水。2、與石蠟切片免疫組化3-8的步驟相同。3、參加SABC-FITC,37℃孵育10-30min，PBS沖洗，5min×4次。4、抗熒光萃滅封片液封片，熒光顯微鏡觀察。9整理課件

冰凍切片熒光免疫組化1、冰凍切片4-8μm，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲(chǔ)存低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后儲(chǔ)存于-20℃冰箱。2、室溫放置30min后，放入4℃丙酮或者4%多聚甲醛固定10-30min。PBS沖洗5min×3次。3、5-10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10-30min。傾去血清，勿洗。4、滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1-2小時(shí)或4℃過(guò)夜。5、PBS沖洗，5min×3次。6、滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育10-30min；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育10-20min。7、PBS沖洗，5min×3次。8、滴加SABC-FITC,37℃孵育10-30min，PBS沖洗5min×3次。9、抗熒光萃滅封片液封片，熒光顯微鏡觀察。10整理課件

細(xì)胞爬片免疫組化1、取出培養(yǎng)皿，用PBS漂洗2min×2次.2、4℃冷丙酮或4%的多聚甲醛固定的細(xì)胞爬片，室溫10-30分鐘。PBS漂洗2min×3次。0.5%TritonX-100室溫處理20min。PBS洗2min×3次，3%過(guò)氧化氫室溫處理15min，PBS洗2min×3次。3、血清封閉：室溫10-30分鐘，傾去。4、一抗：37℃1小時(shí)或4度過(guò)夜5、0.1MPBS洗三次------每次三分鐘。6、相應(yīng)的生物素化二抗37℃30-40分鐘。7、0.1MPBS洗三次------每次三分鐘。8、鏈酶卵白素-堿磷酶復(fù)合物或過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素37℃40min。9、NBT/BCIP或DAB顯色，核固紅或蘇木素復(fù)染。10、切片經(jīng)梯度酒精脫水枯燥，(二甲苯透明)，中性樹(shù)膠封片；11整理課件本卷須知：1、良好的細(xì)胞爬片是進(jìn)行免疫組織細(xì)胞的根底，要獲得良好細(xì)胞爬片須注意以下：〔1〕對(duì)于粘附分子較少的細(xì)胞爬片時(shí)間要達(dá)5天以上，這樣細(xì)胞爬片才較牢固，沖洗時(shí)不易脫片；〔2〕接種的細(xì)胞密度適中，以2*104/ml為宜，假設(shè)細(xì)胞密度太高，5天后細(xì)胞連接成片沖洗時(shí)易脫片；2、冰丙酮固定后玻片可密閉保存于4度冰箱，冰丙酮固定時(shí)會(huì)使細(xì)胞收縮，可用80%冰丙酮或4%多聚甲醛固定。3、沖洗時(shí)只須輕輕振蕩培養(yǎng)皿，〔不可用吸管太用力吹，易脫片〕4、加一抗、二抗后沖洗時(shí)第一次須將玻片傾斜5、TritonX-100〔曲拉通〕外表活性劑，脫去細(xì)胞膜中最主要的成分脂質(zhì)，對(duì)于抗原表達(dá)在胞漿或胞核者方使用，對(duì)于抗原表達(dá)在胞漿者時(shí)間要控制好，使其破壞細(xì)胞膜而核膜破壞較少。12整理課件

免疫組化中常用的固定液1.冷丙酮可用于一般的免疫組化染色。將純的丙酮預(yù)先放入冰箱-20℃后便為冷丙酮〔放心，丙酮在此溫度不會(huì)為固體的〕細(xì)胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可參加冷丙酮于-20℃〔丙酮有很強(qiáng)的揮發(fā)性，注意將含有丙酮和爬片的器皿蓋嚴(yán)，防止其揮發(fā)〕固定10分鐘。取出后，室溫吹干，然后放入-20℃保存。2.多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光以及TUNEL染色。主要檢測(cè)組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞外表抗原，例如各類(lèi)淋巴細(xì)胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等室溫固定15分鐘后，將外表液體吹干，入-20℃保存3.95％乙醇，可用于免疫組化。優(yōu)點(diǎn)：穿透性強(qiáng)、抗原性保存較好。缺點(diǎn)：醇類(lèi)對(duì)低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差，使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過(guò)程中，溫育時(shí)間長(zhǎng)，抗原可流失而減弱反響強(qiáng)度室溫固定15分鐘后，將外表液體吹干，入-20℃保存4.甲醛(福爾馬林)應(yīng)用最廣優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強(qiáng)，缺點(diǎn)：甲醛放置過(guò)久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色；分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能局部或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結(jié)果。返回13整理課件

HE染色

蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosinstaining，HE)是石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一。HE染色法是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中最根本、使用最廣泛的技術(shù)方法。

HE染色的原理：脫氧核糖核酸〔DNA〕兩條鏈上的磷酸基向外，帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵結(jié)合而被染色。伊紅是一種化學(xué)合成的酸性染料，在水中離解成帶負(fù)電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷的陽(yáng)離子結(jié)合使胞漿染成紅色或粉紅色，與藍(lán)色的細(xì)胞核形成鮮明比照。14整理課件石蠟切片HE染色步驟：1、脫蠟水合。2、蒸餾水洗5min×3次。3、蘇木素染液染色，鏡下控制染色時(shí)間。4、水洗玻片上多余染液，0.5-1%鹽酸酒精分色數(shù)秒。5、流水沖洗15-30s，細(xì)胞核呈藍(lán)色。6、0.5%伊紅染液染色1-5min。蒸餾水浸泡5min。7、風(fēng)干，封片。15整理課件細(xì)胞爬片HE染色1、取出細(xì)胞爬片，用PBS洗滌3次。2、樣品固定：95％乙醇固定20min，PBS洗滌2次，每次2min。3、其余步驟和石蠟切片3-7步相同。冰凍切片HE染色1、固定：固定1-2min。(配制方法：40%福爾馬林15mL，95%乙醇80mL，冰乙酸5mL)2、其余步驟和石蠟切片2-7步相同。染色結(jié)果：細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞漿呈紅色，紅細(xì)胞呈桔紅色，其他部位呈深淺不同的紅色。16整理課件返回17整理課件

常用特殊染色一、彈力纖維染色1、彈性纖維主要由彈性蛋白〔一種黃色硬蛋白，它是黃色彈性纖維組織的主要成分，枯燥時(shí)易脆，而濕潤(rùn)時(shí)呈彎曲并富彈性〕構(gòu)成。新鮮時(shí)它呈黃色，固又稱為黃色纖維。彈性纖維較細(xì)，直徑0.2-1.0um，有分支，不成束。但可交織成網(wǎng)。它富有彈性，容易拉長(zhǎng)，但不能拉到超過(guò)它的極限，外力除去后又恢復(fù)原狀。2、彈性纖維染色的臨床應(yīng)用1〕用于區(qū)別正常的動(dòng)脈和靜脈以及觀察動(dòng)脈有病變時(shí)血管壁各層的情況，如動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)的各類(lèi)變化。2〕用于區(qū)別觀察各種疾病對(duì)彈性纖維的影響及變化，如原發(fā)性或繼發(fā)性高血壓可見(jiàn)主動(dòng)脈彈力纖維增生，老年彈力纖維增多癥。心內(nèi)膜彈力纖維增生癥常都可見(jiàn)到彈力纖維斷裂，梅毒性主動(dòng)脈炎和皮膚的環(huán)狀肉芽腫，動(dòng)脈粥樣硬化均可見(jiàn)到裂解，崩解的彈力纖維。3〕用于彈力纖維性假黃瘤的診斷。該病鏡下見(jiàn)真皮中下部結(jié)締組織變性，呈團(tuán)塊狀或條索狀，弱嗜堿性用彈力纖維染色法可以鑒別。18整理課件3、彈性纖維的染色方法：維格特氏雷鎖辛品紅法、Gomori‘s醛品紅法、地衣紅技術(shù)、費(fèi)爾霍夫氏酒精蘇木素技術(shù)。二、Masson染色Masson染色,用于顯示組織中纖維的染色方法之一。一般的Masson染色用的是三色法，苯胺藍(lán)染液使膠原纖維、粘液、軟骨呈藍(lán)色(如光綠液染色為綠色)，Masson麗春紅酸性復(fù)紅液使胞漿、肌肉、纖維素、神經(jīng)膠質(zhì)呈紅色，Regaud氏蘇木精染液使細(xì)胞胞核黑藍(lán)色。三、網(wǎng)狀纖維染色1、網(wǎng)狀纖維在組織化學(xué)上的反響網(wǎng)狀纖維的主要成分是網(wǎng)硬蛋白，在組織化學(xué)上，網(wǎng)狀纖維和膠原纖維是容易區(qū)別的。網(wǎng)狀纖維是分支纖細(xì)的纖維。VanGieson氏染色不顯色或微紅色。PAS反響呈現(xiàn)紅紫色，銀浸染為黑色。膠原纖維用VanGieson氏染色為紅色，PAS反響呈微粉紅色。銀浸染為黃色或棕黃色。19整理課件2、臨床應(yīng)用1〕可用于區(qū)別癌和肉瘤的診斷。例如：網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤和轉(zhuǎn)移于淋巴結(jié)內(nèi)的未分化癌，這兩者在HE的染色切片都較難區(qū)別，前者可產(chǎn)生網(wǎng)狀纖維，后者不產(chǎn)生網(wǎng)狀纖維。鼻咽部活柱，應(yīng)將網(wǎng)染作為常規(guī)，給予使用，可增加診斷的準(zhǔn)確性。2〕可用于區(qū)別血管內(nèi)皮瘤〔肉瘤〕和血管外皮瘤〔肉瘤〕，它的瘤細(xì)胞在網(wǎng)狀纖維膜內(nèi)，而血管外皮瘤那么在網(wǎng)狀纖維膜外，血管內(nèi)皮肉瘤的瘤細(xì)胞呈泡巢狀，周?chē)啾痪W(wǎng)狀纖維包繞；而血管外皮肉瘤的瘤細(xì)胞可見(jiàn)較多的網(wǎng)狀纖維。3〕可用于神經(jīng)系統(tǒng)方面腫瘤的區(qū)別。如：交感神經(jīng)母細(xì)胞，腦的髓母細(xì)胞瘤，這些腫瘤的形態(tài)有時(shí)象肉瘤，但銀染時(shí)，神經(jīng)系統(tǒng)的網(wǎng)染為陰性，不過(guò)腦的原發(fā)性肉瘤有較多的網(wǎng)狀纖維。4〕可用于觀察癌組織的發(fā)生開(kāi)展過(guò)程。如：原位癌，可見(jiàn)有完整的基底膜，而浸潤(rùn)性癌那么可見(jiàn)到被破壞的基底膜。5〕可用于區(qū)別淋巴系統(tǒng)方面的腫瘤。如：淋巴肉瘤和網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤，前者瘤細(xì)胞間的網(wǎng)狀纖維比正常稍減少，后者那么比正常時(shí)增多。6〕可用于急性骨髓纖維化的鑒別診斷，該病的網(wǎng)狀纖維增多，纖維可以是致密和融合性的。膠原纖維染色通常呈陰性，盡管偶爾有的病例可能顯示膠原纖維化。20整理課件四、VanGieson染色1、結(jié)果：膠原纖維染成鮮紅色；肌纖維染成黃色；紅細(xì)胞染成黃色；細(xì)胞核染成藍(lán)黑或灰色。2、臨床應(yīng)用：膠原纖維發(fā)生病變?nèi)鐗乃阑蛲该髯冃詴r(shí)，它與淀粉樣物在HE染色時(shí)被染為粉紅色，不好區(qū)別。應(yīng)用V.G染色法，能將膠原纖維染為粉紅色，而淀粉樣物將被染為黃色。返回21整理課件

敏感性加強(qiáng)型原位雜交〔AP〕原位雜交(ISH)是一種可在細(xì)胞涂片、組織切片以及分裂中期染色體帶中檢測(cè)DNA或RNA的技術(shù)，此方法原理是由DNA或RNA的序列與互補(bǔ)的標(biāo)記單鏈DNA/RNA探針結(jié)合形成標(biāo)記的雙鏈雜交分子，本技術(shù)可對(duì)組織細(xì)胞原位的待測(cè)核酸分子進(jìn)行定性，定量及定位分析。在細(xì)胞分化調(diào)節(jié)、基因定位、腫瘤遺傳學(xué)、分子病理學(xué)、病毒學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。敏感性加強(qiáng)型原位雜交〔AP〕僅適應(yīng)于地高辛高效標(biāo)記的寡核苷酸探針。22整理課件一、培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片1、培養(yǎng)好的細(xì)胞用0.1MPBS洗2min×3次。2、培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片均可用下述方法固定：4%多聚甲醛，室溫固定20-30min。蒸餾水洗，枯燥后-20℃保存。3、暴露mRNA核酸片段。胃蛋白酶37℃消化5-120s，0.5MTBS洗滌5min×3次，蒸餾水洗滌1次。4、預(yù)雜交5、雜交6、雜交后洗滌7、滴加封閉液。37℃30min8、滴加生物素化鼠抗地高辛。37℃60min23整理課件9、0.5MTBS洗滌5min×4次。10、滴加SABC-AP37℃20min。0.5MTBS洗滌5min×4次。11、BCIP/NBT顯色，核固紅復(fù)染。13、風(fēng)干，水溶性封片劑封片。二、石蠟切片1、常規(guī)脫蠟至水。2、3%過(guò)氧化氫室溫處理10min，蒸餾水洗5min×2次.3、暴露暴露mRNA核酸片段。胃蛋白酶37℃消化10-30min，0.5MTBS洗滌5min×3次，蒸餾水洗滌1次。4、其余步驟和冰凍切片4-13步相同。24整理課件三、結(jié)果觀察陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿著色呈深藍(lán)色或藍(lán)紫色，細(xì)胞核著色呈紅色〔圖片〕四、本卷須知1、石蠟切片水合時(shí)所用的不同濃度酒精用0.1%DEPC水配制。2、緩沖液配制時(shí)要用滅菌水來(lái)配。3、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用的3%檸檬酸需現(xiàn)配現(xiàn)用。4、在冰凍切片原位雜交實(shí)驗(yàn)中最重要的組織及細(xì)胞的及時(shí)固定，并在固定液中參加0.1%的DEPC水處理，以抑制RNA酶對(duì)mRNA的分解作用。5、石蠟切片脫蠟時(shí)要用新的二甲苯浸泡，不能要以前浸泡過(guò)切片的二甲苯脫蠟。返回25整理課件microRNA原位雜交圖片返回26整理課件

熒光原位雜交〔FISH〕熒光原位雜交技術(shù)(florescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)是一