紅木葉抑菌活性成分提取與萃取液的萃取

紅木葉抑菌活性成分提取與萃取液的萃取

柴油木材又稱樹脂、堅(jiān)樹、玉輪樹等，為金縷梅科多年生樹木。這是多年生灌木和小樹。紅色魚條屬于樹脂。我國主要分布在長江中下游以南、北回歸線以北地區(qū),湖南地區(qū)藏量十分豐富。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,檵木枝條中含鞣質(zhì),種子中含脂肪油,花中含異槲皮苷,葉中含鞣質(zhì)、還原糖、苷類、黃酮類、酚性物質(zhì)及有機(jī)酸;檵木根、葉和花均可入藥,具有清暑解熱、止咳、止血、止瀉、消炎、鎮(zhèn)痛等功效,可用于治療咳嗽,硌血,痢疾、暑瀉、外傷出血、燒傷、紫斑病、腹痛等癥;湘西民間常用檵木鮮葉煎服治療腹瀉有奇效。目前,有關(guān)檵木葉中抑菌活性成分的深入研究報(bào)道不多,僅盧成英等以檵木葉為材料,用60%乙醇在45℃下提取,選用不同樹脂經(jīng)柱層析和梯度洗脫,經(jīng)抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,檵木葉提取液中含有多種抑菌活性成分,其中主要可能為香豆素類。本研究通過對(duì)紅檵木葉中抑菌活性成分進(jìn)行提取和初步分離,對(duì)具較強(qiáng)抑菌活性的萃取液進(jìn)行薄層分離制備,將各層析點(diǎn)經(jīng)溶解解析后,進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)和化學(xué)鑒定,確定其中所含抑菌活性成分的種類,以期為紅檵木葉中抑菌活性物質(zhì)的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1紅木、陰干處理、粉碎制備本實(shí)驗(yàn)所用的紅檵木葉為2006年3月中旬采于吉首大學(xué)張家界校區(qū)校園內(nèi)。經(jīng)吉首大學(xué)城鄉(xiāng)資源與規(guī)劃學(xué)院廖博儒副教授鑒定為紅檵木(Loropetalumchinensevar.rubrumYieh),陰干處理、粉碎后備用。金黃色葡萄球菌(Staphylococlusaureus)、大腸桿菌(Escheichiacolis)和痢疾桿菌(Shigelladysenteroae)湖南省疾病預(yù)防控制中心。1.1.2試劑實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國產(chǎn)分析純;對(duì)照品四環(huán)素湖北省鄂州市生物化學(xué)制藥廠;層析用硅膠G(化學(xué)純)青島海洋化工集團(tuán)。1.1.3培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基制備無菌試管斜面、平板備用。1.1.4m-53高壓蒸汽滅菌器PCH-1303BN超凈工作臺(tái);PW/10-002恒溫培養(yǎng)箱;SM-52高壓蒸汽滅菌器;YamatoRE-540旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀日本;HH-W21.Cr420恒溫水浴鍋;醫(yī)用LD5-2A臺(tái)式離心機(jī);AEG-220萬分之一天平;SJ-1031A紫外線檢出器日本。1.2方法1.2.1乙醇的提取稱取經(jīng)處理的紅檵木葉粗粉50g置于燒瓶中,加入60%乙醇200ml于45℃下回流提取2h。趁熱過濾,濾渣加入相同體積的乙醇重復(fù)提取一次,合并兩次所得濾液。將濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至50ml后分步萃取,先用50ml石油醚分三次萃取,得萃取液I,接著用50ml氯仿分三次萃取,得萃取液II,再用50ml乙酸乙酯分三次萃取,得萃取液III,最后用50ml正丁醇分三次萃取,得萃取液IV,原液萃取余液為萃余液V,原提取液(未萃取)為VI。1.2.2制作明膠g板硅膠G薄板按文獻(xiàn)中的方法制備,于烘箱中110℃烘干活化1h,冷卻后貯于干燥箱內(nèi)備用。1.2.3環(huán)素對(duì)照組分別取提取及萃取液0.2ml置無菌小瓶中,放入Φ6mm無菌濾紙片20片,45℃下干燥備用,另設(shè)有四環(huán)素(100μg/ml)和95%乙醇作對(duì)照。取0.2ml菌懸液置于平板上,用L型玻棒涂布均勻,將上述藥敏紙片等距離置于含菌平板上,然后置于37℃下培養(yǎng)24h后觀測記錄結(jié)果。1.3抗菌活性物質(zhì)的分離和制備1.3.1最佳開口的研究對(duì)抑菌效果最佳的萃取液分別選用九種展開劑進(jìn)行薄層層析,摸索最佳展開劑。1.3.2層板及濾液的制備將抑菌效果最佳的萃取液以直線均勻點(diǎn)于數(shù)塊硅膠G薄層板上,用最佳展開劑進(jìn)行分離,在紫外燈下確定各點(diǎn)位置后用小刀刮下,以乙酸乙酯為溶劑將吸附在硅膠中活性成分溶解解吸,離心、過濾,將濾液濃縮定容10ml。1.3.3抗菌試驗(yàn)用各層析點(diǎn)濃縮液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),分別測其抑菌圈直徑,以確定各層析點(diǎn)的抑菌活性。1.4紅棕葉抗菌活性物質(zhì)的初步化學(xué)測定對(duì)抑菌實(shí)驗(yàn)證明有抑菌作用的層析點(diǎn)提取液進(jìn)行物理和化學(xué)檢測,初步判斷其所含物質(zhì)種類,為進(jìn)一步分離鑒定奠定基礎(chǔ)。2結(jié)果與分析2.1對(duì)各微生物的抑菌圈平均直徑的影響按1.2.1方法對(duì)紅檵木葉中抑菌活性成分進(jìn)行提取及初步分離,并對(duì)提取及萃取液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表1。由表1可知,對(duì)于各供試菌種的抑菌效果基本均以萃取液III的效果最佳。對(duì)于大腸桿菌,其抑菌圈平均直徑達(dá)16.0mm,較之陽性對(duì)照物四環(huán)素的直徑大5.5mm,高出52.4%;對(duì)于金黃色葡萄球菌,其抑菌圈平均直徑達(dá)16.7mm,比陽性對(duì)照物四環(huán)素的平均抑菌直徑大7.2mm,高出75.8%;對(duì)于痢疾桿菌,其抑菌圈平均直徑14.6mm,比陽性對(duì)照物四環(huán)素的平均抑菌直徑大4.5mm,高出47.4%。萃取液III的抑菌效果較原提取液VI還略為明顯,說明紅檵木葉中的抑菌活性成分可能主要為易溶于乙酸乙酯的成分。2.2最佳展開劑測試結(jié)果對(duì)最具抑菌作用的萃取液III進(jìn)行薄層層析,摸索最佳展開劑,結(jié)果見表2。由表2可知,氯仿:丙酮:甲酸:氨水(60:35:5:3)的展開劑分離效果最好,選用此展開劑對(duì)萃取液III進(jìn)行分離制備。2.3紅木葉主要抑菌成分測定結(jié)果選用最佳展開劑對(duì)萃取液III進(jìn)行薄層制備,得七個(gè)區(qū)帶,刮下各點(diǎn)用乙酸乙酯溶解,離心、過濾、濃縮后,定容至10ml,再進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表3。由表3可知各層析點(diǎn)乙酸乙酯溶解液對(duì)各供試菌種抑菌效果均不明顯,由于萃取液III本身的抑菌效果較好,而各層析點(diǎn)乙酸乙酯溶解液的抑菌效果不佳,考慮是否是因?yàn)橐志钚猿煞譀]有被乙酸乙酯溶解解析下來,故對(duì)乙酸乙酯溶解解吸后的硅膠濾渣再用甲醇溶解,離心、過濾、濃縮后定容至10ml,再進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表4。由表4可知,對(duì)于大腸桿菌,以層析點(diǎn)III、V、VI、VII有一定抑菌效果,平均抑菌圈直徑分別為8.8、8.8、8.7、10.8mm,比95%乙醇對(duì)照品平均抑菌圈直徑分別大1.8、1.8、1.7、3.8mm,分別高出25.7%、25.7%、24.3%、54.3%。對(duì)于金黃色葡萄球菌,以層析點(diǎn)II、III、VI、VII有一定抑菌效果,平均抑菌圈直徑分別為9.0、9.5、8.3、10.2mm,比95%乙醇對(duì)照品平均抑菌圈直徑分別大1.5、2.0、0.8、2.7mm,分別高出20.0%、26.7%、10.7%、36.0%。對(duì)于痢疾桿菌,以層析點(diǎn)II、III、VI、VII有一定抑菌效果,平均抑菌圈直徑分別為9.7、9.5、8.5、10.7mm,比95%乙醇對(duì)照品平均抑菌圈直徑分別大2.5、2.3、1.3、3.5mm,分別高出34.7%、31.9%、18.1%、48.6%。由以上分析可以推斷層析點(diǎn)II、III、V、VI、VII所含物質(zhì)可能為紅檵木葉中的主要抑菌成分。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中還可以看出,各薄層層析點(diǎn)的抑菌效果仍不及對(duì)照品四環(huán)素好,因此對(duì)甲醇溶解解吸后的各點(diǎn)硅膠濾渣進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表5。從表5可以看出,各點(diǎn)硅膠濾渣抑菌效果仍較明顯,說明經(jīng)甲醇溶解解析后的各層析點(diǎn)硅膠上仍含有部分抑菌活性成分。2.4層析點(diǎn)溶解液可能含有采用香豆素類物質(zhì)將各層析點(diǎn)用甲醇溶解、濃縮,對(duì)經(jīng)抑菌實(shí)驗(yàn)有效果者進(jìn)行物理和化學(xué)檢測,初步確定各層析點(diǎn)化學(xué)成分。經(jīng)薄層層析分離,層析點(diǎn)Ⅵ在紫外光下有較強(qiáng)的藍(lán)色熒光,溶解液進(jìn)行異羥肟酸鐵反應(yīng)試驗(yàn),有紅色產(chǎn)生,推測可能為香豆素類物質(zhì)。層析點(diǎn)Ⅶ溶解液加入1%三氯化鐵溶液,呈墨綠色反應(yīng);加入新配制的10%氯化鈉的0.5%明膠水溶液有白色沉淀產(chǎn)生,由此推測層析點(diǎn)Ⅶ溶解液中可能含有鞣質(zhì)類化合物。其他層析點(diǎn)甲醇溶解液可能因其中抑菌活性成分含量較少,所以經(jīng)化學(xué)檢識(shí)未能予以檢出其化學(xué)成分。3薄層層析抑菌活性成分3.1對(duì)紅檵木葉中抑菌活性成分進(jìn)行提取、初步分離及薄層制備,經(jīng)抑菌實(shí)驗(yàn)和化學(xué)檢識(shí),初步確定紅檵木葉中具抑菌活性的成分有香豆素類和鞣質(zhì)類,其究竟為何種單體物質(zhì),有待進(jìn)一步研究。3.2萃取液III的抑菌效果較原提取液VI還略為明顯,說明紅檵木葉中的抑菌活性成分可能主要為易溶于乙酸乙酯的物質(zhì)。3.3紅檵木葉中抑菌活性成分乙酸乙酯萃取液薄層層析最佳展開劑為氯仿:丙酮:甲酸:水(60:35:5:2)。3.4薄層層析各點(diǎn)乙酸乙酯溶解液對(duì)供試菌種抑菌效果均不明顯,這是否表明乙酸乙酯雖然對(duì)紅檵木葉中的抑菌活性成分溶解性能較好,但對(duì)經(jīng)薄層制備分離后吸附在硅膠上的抑菌活性成分的解析能力較差,該問題今后應(yīng)盡快予以探明。3.5乙酸乙酯溶解后的各薄層層析點(diǎn)硅膠濾渣用甲醇溶解、離心、過濾、濃縮定容后,再進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),雖然對(duì)供試菌種有一定抑菌效果,但其抑菌效果