不同濾紙對(duì)齦溝液收集的影響

不同濾紙對(duì)齦溝液收集的影響

牙齦出血（tcf）是牙齦組織的滲出物。它的成分來(lái)自血清和牙齦組織的局部。近年來(lái),對(duì)于齦溝液的研究除了其分泌量以及各成分的變化與牙周炎癥的相關(guān)性之外,越來(lái)越多地涉及口腔正畸、口腔修復(fù)、口腔種植及其與系統(tǒng)性疾病的相互關(guān)系等方面。Page認(rèn)為,齦溝液作為檢測(cè)患者牙周病易感程度的主要研究樣本之一最具潛力。Javed等指出,對(duì)種植體周圍齦溝液(peri-implantcrevicularfluid,PICF)中細(xì)胞因子水平的監(jiān)測(cè),有助于檢測(cè)尚未出現(xiàn)臨床癥狀的早期炎癥。齦溝液采集是對(duì)齦溝液進(jìn)行相關(guān)研究的基礎(chǔ)。齦溝液采集方法一般有齦溝液沖洗法、微吸管法和濾紙條法,其中,以濾紙條法最為常用。齦溝液的定量方法有茚三酮染色法、稱重法、檢測(cè)齦溝液在濾紙條上的遷移距離和使用齦溝液測(cè)量?jī)x(Periotron)。其中,使用齦溝液測(cè)量?jī)x最為精確方便,但其價(jià)格昂貴且檢測(cè)范圍小,如Periotron8000檢測(cè)的理想范圍為0.1~1.2μL,這些都限制了Periotron在臨床上的應(yīng)用。目前,我國(guó)多采用自制濾紙條采集齦溝液樣本[2,3,4,5,12,13,14,15]。本研究通過體外實(shí)驗(yàn),對(duì)whatman3MM層析濾紙和whatman3#定性濾紙?jiān)谑占l溝液及蛋白萃取等方面進(jìn)行比較,為臨床研究中選用合適濾紙采集齦溝液提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1蛋白濃度測(cè)定whatman3MM層析濾紙(Whatman,英國(guó));whatman3#定性濾紙(Whatman,英國(guó));正常人血清;0.9%NaCl溶液(上海長(zhǎng)征富民金山制藥有限公司,中國(guó));品紅溶液;0.5mLEp管(Axygen,美國(guó));BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)(碧云天生物技術(shù)研究所,中國(guó));0.1~2.5μL、2~20μL、20~200μL和100~1000μL量程的微量加樣器(Eppendorf,德國(guó));96孔板(Corning,美國(guó));Zeiss立體顯微鏡(Zeiss,德國(guó));WH-1微型漩渦混合儀(金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司,中國(guó));TOMOSMiniStar微型迷你離心機(jī)(上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司,中國(guó));恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司,中國(guó));BioRad2550自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio-Rad,美國(guó))。1.2方法1.2.1濾紙的制備將whatman3MM層析濾紙和whatman3#定性濾紙裁成2mm×8mm大小的濾紙條,置于干凈容器中備用。whatman3MM層析濾紙?jiān)O(shè)為A組,whatman3#定性濾紙?jiān)O(shè)為B組。1.2.2血清品紅溶液添加量觀察在正常人血清中滴入少量品紅溶液,使其染色便于觀察。使用微量加樣器,在各組15個(gè)樣本上依次加入0.1~1.5μL血清品紅溶液(0.1μL依次遞增)。Zeiss立體顯微鏡下觀察,SPOT4.6軟件拍照、測(cè)量每張濾紙條上溶液浸潤(rùn)長(zhǎng)度,重復(fù)4次。計(jì)算獲得浸潤(rùn)長(zhǎng)度與溶液體積的相關(guān)性,并比較2種濾紙的差異。1.2.3血清中pacl的濃度使用微量加樣器在A、B組濾紙條上分別依次加入0.3、0.6、0.9、1.2、1.5μL正常人血清。同體積重復(fù)5次。將各濾紙條分別浸于盛有200μL0.9%NaCl溶液的Ep管中,靜置30min。震蕩5min,離心1min。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)測(cè)定各萃取液的總蛋白濃度,比較2組差異。1.2.4血清萃取及蛋白濃度測(cè)定用0.9%NaCl溶液將正常人血清等倍稀釋,獲得5個(gè)不同濃度(C16、C/8、C/4、C/2、C)的血清溶液。使用微量加樣器在A、B組濾紙條上分別依次加入5種濃度的血清溶液1μL。同濃度重復(fù)5次。萃取及蛋白濃度測(cè)定方法同1.2.3。比較2組差異。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示,采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。溶液浸潤(rùn)長(zhǎng)度與溶液體積的關(guān)系采用線性回歸分析,2組差異采用方差分析,P<0.05為差異具有顯著性。2結(jié)果2.1濾紙條中溶液浸漬長(zhǎng)度與溶液體積相關(guān)性分析A、B2組溶液浸潤(rùn)長(zhǎng)度與溶液體積的擬合曲線見圖1、2。圖1中,R2=0.995,圖2中,R2=0.995,表明A、B2組濾紙條中溶液浸潤(rùn)長(zhǎng)度與溶液體積均呈良好的線性關(guān)系。表1為A、B2組濾紙條中溶液浸潤(rùn)長(zhǎng)度與溶液體積相關(guān)性的比較。溶液體積為0.1μL時(shí),溶液平均浸潤(rùn)長(zhǎng)度A<B,其余各體積均A>B。經(jīng)方差分析,2組溶液浸潤(rùn)長(zhǎng)度有顯著差異(P<0.05)。2.2蛋白萃取性能測(cè)定表2為相同濃度、不同體積正常人血清A、B2組濾紙條的蛋白萃取性能比較結(jié)果。經(jīng)方差分析,A、B2組的萃取液總蛋白濃度無(wú)顯著差異(P>0.05)。2.3濾紙條的萃取性能測(cè)定表3為相同體積、不同濃度正常人血清A、B2組濾紙條的蛋白萃取性能比較結(jié)果。經(jīng)方差分析,A、B2組的萃取液總蛋白濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3濾紙條的蛋白回收性能測(cè)定已發(fā)現(xiàn)齦溝液含有幾十種成分,目前,對(duì)于齦溝液的研究包括口腔修復(fù)學(xué)、牙周病學(xué)、口腔正畸學(xué)、口腔種植學(xué)及其與系統(tǒng)性疾病的相互關(guān)系等多個(gè)領(lǐng)域。國(guó)內(nèi)在對(duì)齦溝液的研究中,多使用溝內(nèi)法采集齦溝液,但所選用的濾紙種類不一,常見的有whatman1#定性濾紙、whatman3#定性濾紙、whatman3MM層析濾紙等。究竟哪種濾紙?jiān)诓杉l溝液方面性能更優(yōu),研究中選用哪種濾紙均需要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。陳智濱等通過比較吸潮紙尖與傳統(tǒng)濾紙條采集齦溝液樣本質(zhì)和量的差異,認(rèn)為吸潮紙尖可以替代傳統(tǒng)手工裁剪的濾紙條。但目前國(guó)內(nèi)外眾多對(duì)于齦溝液的研究中,使用濾紙作為采樣材料仍為主流。Griffiths等對(duì)periopaper(Harco)、whatman1#層析濾紙、whatman4#層析濾紙和whatman3MM層析濾紙4種濾紙進(jìn)行比較,認(rèn)為2mm×8mm大小的whatman3MM層析濾紙條對(duì)血清蛋白的回收率最高。Johnson等對(duì)whatman1#濾紙、whatman3MM層析濾紙、periopaper(ProFlow)和periopaper(Harco)4種濾紙條蛋白回收性能進(jìn)行比較,認(rèn)為不同濾紙條對(duì)蛋白的洗提和回收的效率不同,whatman濾紙優(yōu)于periopaper濾紙,并指出早先各研究小組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異可能與GCF蛋白從濾紙條上不完全洗提有關(guān),而這種不完全洗提歸因于蛋白在濾紙條上的黏附和濾紙條對(duì)蛋白的截留。本研究中,A組whatman3MM層析濾紙和B組whatman3#定性濾紙的溶液浸潤(rùn)長(zhǎng)度與溶液體積均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,表明可采用齦溝液在濾紙條上的遷移距離來(lái)對(duì)所采集的齦溝液進(jìn)行定量。2組溶液浸潤(rùn)長(zhǎng)度的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,除體積為0.1μL時(shí),A組濾紙條上的溶液浸潤(rùn)長(zhǎng)度均大于B組,表明相同大小的2種濾紙條,whatman3#定性濾紙所收集的齦溝液量大于whatman3MM層析濾紙。根據(jù)Whatman公司產(chǎn)品介紹中所給出的數(shù)據(jù),A的厚度為0.34mm,B的厚度為0.39mm。因此,理論上,相同大小的2種濾紙條所收集的齦溝液量B大于A,與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符?？梢哉J(rèn)為,當(dāng)齦溝液分泌量較大,相同時(shí)間內(nèi)所采集的齦溝液樣本較多,如牙周炎癥較重時(shí),選用whatman3#定性濾紙優(yōu)于whatman3MM層析濾紙。個(gè)體的齦溝液總蛋白濃度不同,且單位時(shí)間內(nèi)齦溝液的分泌量也不同,又因齦溝液是血清的滲出液,因此,本實(shí)驗(yàn)采用相同濃度不同體積以及相同體積不同濃度的正常人血清溶液對(duì)A、B2種濾紙的蛋白萃取性能進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,2組的萃取液總蛋白濃度無(wú)顯著差異。這可能與2種濾紙的顆粒保留孔徑大小相近,對(duì)蛋白的截留性能接近有關(guān)。蛋白質(zhì)的黏附特性隨濾紙種類的不同而有所差別,濾紙的蛋白萃取效率與濾紙的種類及蛋白的濃度密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)A、B2組所使用的蛋白溶液相同,為同一正常人血清或血清溶液,且根據(jù)Whatman公司產(chǎn)品介紹,兩者均為纖維素類濾紙。因此,whatman3MM層析濾紙和whatman3#定性濾紙對(duì)相同蛋白溶液的萃取效率無(wú)顯著差別。綜上所述,whatman3MM層析濾