川楝子中黃酮類化合物的提取

川楝子中黃酮類化合物的提取

黃酮類化合物是一種多酚類化合物，廣泛分布于自然界，許多植物可以合成。大量研究表明,黃酮類化合物具有清除自由基、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、防治血管硬化和降血糖等功能。川楝子,別名金鈴子,為楝科植物川楝(MeliatoosendanSie.EtZucc.)的果實(shí),為較常用的中藥。川楝子中含總黃酮約為3%,具有較高的利用價(jià)值。川楝黃酮對羥基自由基和超氧陰離子自由基有很好的清除作用,當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到12.38g/L時(shí),對羥基自由基的清除效率達(dá)到84%;當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到9.74g/L時(shí),對超氧陰離子自由基的清除效率達(dá)到76.6%。由此可以看出對川楝黃酮研究的重要性。作者主要研究了以50%乙醇為溶劑,采用超聲波法提取川楝子中的黃酮類化合物,提取物經(jīng)有機(jī)溶劑萃取分離和聚酰胺柱層析純化后,將所得到的黃酮類化合物通過薄層層析、顏色反應(yīng)和高效液相色譜分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究。1材料和方法1.1原材料川楝子,2008年9月采摘于四川省宜賓市林業(yè)局。1.2超聲波提取法川楝子洗凈、去核、粉碎后準(zhǔn)確稱取一定量于燒杯中,加入50%的乙醇溶液,料液比1∶40(g∶mL,下同),在80℃下超聲波提取40min,得到提取液,總黃酮得率為0.561%。1.3化合物的分離和表征提取液經(jīng)減壓蒸餾濃縮成浸膏,加入熱水將浸膏溶解后,依次用石油醚萃取5次、乙酸乙酯萃取4次、正丁醇萃取4次,分別濃縮各萃取液至浸膏狀并回收萃取劑,取正丁醇萃取液浸膏進(jìn)行聚酰胺柱層析,得到化合物供結(jié)構(gòu)鑒定。1.4氯化鋁-甲醇溶液顯色劑試驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)各階段所得液體采用硅膠G板進(jìn)行薄層層析分析,以正丁醇-冰醋酸-水體積比4∶1∶5為展開劑,蘆丁-甲醇溶液為對照品。展開后,用2%的三氯化鋁-甲醇溶液作顯色劑,將板置于紫外燈下觀察,記錄并計(jì)算Rf值。根據(jù)層析結(jié)果初步判斷液體中所含成分、純度及其結(jié)構(gòu)。1.5顯色試劑的選擇取樣品溶液與HCl-Mg、HCl-Zn、10%NaOH、濃H2SO4、AlCl3-CH3CH2OH等5種顯色試劑進(jìn)行顏色反應(yīng),反應(yīng)后在可見光下觀察其顏色變化,初步判斷其黃酮類化合物所屬類型。1.6色譜檢測條件在正丁醇萃取浸膏中加入80%的甲醇溶液,配制成質(zhì)量濃度為31g/L的溶液,加入1/4甲醇量(體積)的濃度為4mol/L的HCl溶液,攪拌均勻,置于水浴鍋中78℃恒溫2h。水解完畢后將水解液置于離心機(jī)中以3000r/min離心5min,取上層清液1mL用80%甲醇溶液稀釋至15mL,經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾,濾液待檢測。色譜柱為SunfireC18柱(4.6mm×250mm);柱填料5μm;柱溫為室溫;檢測器為紫外檢測器;檢測波長365nm;流動(dòng)相為70%甲醇;pH值3;流速0.8mL/min。2結(jié)果與討論2.1標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁的rf川楝子的乙醇提取液經(jīng)石油醚萃取后按1.4節(jié)操作,在可見光和紫外光下均無斑點(diǎn),這說明川楝子的乙醇提取液經(jīng)過石油醚萃取后,其萃取液中不含有黃酮類化合物。石油醚萃余液經(jīng)過乙酸乙酯萃取后,萃取液經(jīng)薄層層析后噴入顯色劑,得到3個(gè)在254nm紫外光下顯黃色的斑點(diǎn),Rf1=0.69、Rf2=0.795、Rf3=0.892,標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁的Rf=0.68。說明石油醚萃余液經(jīng)乙酸乙酯萃取后,萃取液中含有3個(gè)黃酮類化合物。乙酸乙酯萃余液經(jīng)過正丁醇萃取后,萃取液經(jīng)薄層層析后噴入顯色劑,得到2個(gè)在254nm紫外光下顯黃色的斑點(diǎn),其Rf1=0.612、Rf2=0.682,說明乙酸乙酯萃余液經(jīng)正丁醇萃取后,其萃取液中含有2個(gè)黃酮類化合物。正丁醇萃余液經(jīng)薄層層析后噴入顯色劑,得到一個(gè)在254nm紫外光下顯黃色的斑點(diǎn),Rf1=0.69,說明正丁醇萃余液中含有1個(gè)黃酮類化合物。2.2洗脫溶劑成分以蒸餾水、10%、30%、50%、75%、95%、100%(體積分?jǐn)?shù),下同)梯度乙醇為洗脫劑,采用聚酰胺柱層析純化正丁醇萃取物,收集各乙醇洗脫液,共26個(gè)流分,其中蒸餾水洗脫劑收集2個(gè)流分,其余洗脫劑均收集4個(gè)流分。取各流分進(jìn)行薄層層析分析。結(jié)果表明:50%乙醇洗脫液的第2、第3流分為相同流分,合并,其經(jīng)過減壓蒸餾濃縮、低溫處理后析出粉末狀晶體,反復(fù)結(jié)晶后為流分Ⅰ,其在254nm紫外光下顯黃色的斑點(diǎn),Rf=0.612;75%乙醇洗脫液的第4流分和95%乙醇洗脫液的第1流分為相同流分,合并,經(jīng)過減壓蒸餾濃縮、低溫處理后析出粉末狀晶體,反復(fù)結(jié)晶后為流分Ⅱ,其在254nm紫外光下顯黃色的斑點(diǎn),Rf=0.682。柱層析結(jié)果表明:川楝子提取物的正丁醇萃取液經(jīng)過柱層析后分離純化,經(jīng)薄層層析進(jìn)行檢識,合并相同流分后得到流分Ⅰ、Ⅱ,并初步判定其中含有2種黃酮類化合物。2.3色試劑的選擇將經(jīng)過柱層析分離純化的流分Ⅰ、Ⅱ取出,溶解于無水乙醇中分別與以下5種顏色反應(yīng)試劑進(jìn)行顏色反應(yīng),其結(jié)果如下。從顏色反應(yīng)可以初步判斷,川楝子提取液經(jīng)過有機(jī)溶劑萃取后,在正丁醇萃取液中含有黃酮類或黃酮醇類化合物。2.4水解流分測定實(shí)驗(yàn)中提取的黃酮類化合物流分Ⅰ、Ⅱ多為黃酮苷,經(jīng)水解為苷元和糖配基,以標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁、槲皮素、桑色素為對照,用高效液相色譜法測定水解后的流分。圖1(a)是流分Ⅰ的HPLC譜圖,與標(biāo)準(zhǔn)樣品譜圖對照發(fā)現(xiàn),6.403和11.220min處的信號峰分別源自于蘆丁和桑色素。圖1(b)為流分Ⅱ的HPLC譜圖,蘆丁的信號峰出現(xiàn)在6.293min。3化合物結(jié)構(gòu)分析3.1通過薄層層析分析表明川楝子提取液經(jīng)連續(xù)萃取后,石油醚萃取液中不含黃酮類化合物,乙酸乙酯萃取液中含有3個(gè)黃酮類化合物,正丁醇萃取液中含有2個(gè)黃酮類化合物,萃余液中含有1個(gè)黃酮類化合物。3.2正丁醇萃取液經(jīng)過柱