淺談腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的體會(huì)

淺談腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的體會(huì)

細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)主要是指在外部條件下，細(xì)胞觸摸體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，并在外部繼續(xù)培養(yǎng)和擴(kuò)展。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與生命科學(xué)的不斷發(fā)展,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因工程、遺傳工程等生命科學(xué)的眾多領(lǐng)域,尤其在醫(yī)學(xué)科學(xué)研究和研究生教學(xué)中已經(jīng)成為必要掌握的最普遍的科研手段。要學(xué)會(huì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)并不難,但要培養(yǎng)好一種細(xì)胞并很好地應(yīng)用于科研、長(zhǎng)期保存并不容易。現(xiàn)以腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)(包括復(fù)蘇、傳代、凍存等)為例,淺談我們?cè)谀[瘤細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的體會(huì),供同仁們參考。一、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中易出現(xiàn)的問(wèn)題1.培養(yǎng)基、牛血清污染制品等清洗的不徹底,未按要求洗至10遍,減少泡酸、泡堿的程序,高壓后未及時(shí)烘干放入無(wú)菌室,細(xì)胞室消毒不嚴(yán)、沒(méi)有用甲醛和高錳酸鉀溶液熏蒸,操作過(guò)程中二次污染,培養(yǎng)基、牛血清配置分裝再度污染等。2.培養(yǎng)基、培養(yǎng)基、酸液用完后換上自己配制的培養(yǎng)基,細(xì)胞就越長(zhǎng)越少,最終死掉。原因很多,如污染長(zhǎng)細(xì)菌,培養(yǎng)基、牛血清酸堿度不合適、培養(yǎng)環(huán)境差,不適合細(xì)胞生長(zhǎng)等。以上兩種情況是腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中最容易出現(xiàn)的現(xiàn)象。如經(jīng)常發(fā)生,會(huì)給科研工作者信心造成沉重的打擊,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)緩慢或失敗。二、改進(jìn)方法1.無(wú)菌和完整的培訓(xùn)環(huán)境細(xì)胞培養(yǎng)室的條件非常關(guān)鍵。細(xì)胞室選適合細(xì)胞培養(yǎng)流程清潔級(jí)的、溫差變化不大的房間,房間布局合理、儀器設(shè)備配備齊全。2.做好培養(yǎng)程序從培養(yǎng)瓶、離心管、EP管、凍存管等的清洗到高壓滅菌以及細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代、凍存都要嚴(yán)格按照無(wú)菌要求操作。高壓后的培養(yǎng)用具要迅速烘干放入無(wú)菌室備用。避免中途污染。3.培養(yǎng)基ph值的配置(1)常用培養(yǎng)基。RPMI-1640培養(yǎng)基(購(gòu)自GIBCO公司),廣泛適用于多種正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)。特別適用于白血病細(xì)胞株的培養(yǎng)。配制:RP-MI-1640培養(yǎng)基1L、三蒸水1L、青霉素0.5ml、鏈霉素0.5ml、NaHCO31.9g.進(jìn)行配置。上述溶液配好后,用過(guò)濾法消毒除菌,分裝于玻璃瓶中備用。按照要求NaHCO3是2.0g。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)用1.9g配置出的培養(yǎng)基pH值剛在7.0~7.2之間。NaHCO3用2.0g,配出的培養(yǎng)基PH值就容易偏高,而且培養(yǎng)基放的時(shí)間越長(zhǎng),PH值就逐漸增高,細(xì)胞在偏堿的環(huán)境中就不長(zhǎng)。如果培養(yǎng)基配置不好,在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中再調(diào)PH值就非常麻煩,每次換培養(yǎng)基時(shí),都要測(cè)PH值,及時(shí)調(diào)整到合適,一定要避免污染。PH值的變化是影響細(xì)胞生長(zhǎng)的重要因素。(2)血清的選擇與配置。小牛血清或胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)56℃滅活30min,在無(wú)菌操作臺(tái)過(guò)濾分裝到1.5ml或2ml的EP管內(nèi),-20℃冰箱內(nèi)保存。培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)從-20℃到4℃逐漸溶解,避免冷熱變化過(guò)急對(duì)血清中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)活性的影響。(3)EDTA的配置。取0.04gEDTA溶于100mlD-HanKs液中,高壓滅菌過(guò)濾分裝,4℃冰箱保存。(4)胰蛋白酶配置。100mlD-HanKs液中加胰蛋白酶0.5g。胰蛋白酶偏酸,使用前調(diào)至PH值至7.2左右。細(xì)胞消化液的配置EDTA和胰蛋白酶各取50ml混勻,過(guò)濾除菌分裝于-200℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.細(xì)胞傳代、凍存和培養(yǎng)(1)凍存細(xì)胞的復(fù)蘇。迅速?gòu)囊旱藁虻蜏乇渲腥〕黾?xì)胞凍存管,快速放入37℃水浴箱中,大約1分鐘左右,從水浴中取出迅速拿入無(wú)菌操作臺(tái)進(jìn)行復(fù)蘇。復(fù)蘇前細(xì)胞培養(yǎng)室要進(jìn)行嚴(yán)格的消毒,復(fù)蘇過(guò)程時(shí)間越短,細(xì)胞成活的就越多。(2)細(xì)胞的傳代。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)旺盛達(dá)到瓶底3/4時(shí)就要進(jìn)行傳代,培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞不能太少,也不能鋪的很滿過(guò)了旺盛期。否則細(xì)胞傳代后生長(zhǎng)不好。傳代時(shí)把培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的液體輕輕倒掉,按胰蛋白酶與EDTA按1:1的混合物(細(xì)胞消化的時(shí)間短,消化徹底且對(duì)細(xì)胞損傷小)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化。置室溫內(nèi)消化3~5分鐘后按常規(guī)操作進(jìn)行傳代。(3)細(xì)胞凍存。腫瘤細(xì)胞常用DMSO。凍存液配置:RPMI-1640培養(yǎng)基70%~80%,DM-SO(北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司)10%,新生牛血清或胎牛血清10%~20%.現(xiàn)配現(xiàn)用。冷凍經(jīng)過(guò)水液態(tài)—冰態(tài)加水態(tài)—冰態(tài)三個(gè)階段,降溫的速率十分重要,我們按照4℃冰箱40min,-20℃冰箱60min,-80℃冰箱內(nèi)過(guò)夜保存或液氮罐長(zhǎng)期保存。效果良好。DMSO對(duì)細(xì)胞有一定毒性,應(yīng)在細(xì)胞復(fù)蘇后及時(shí)清洗掉殘留的DMSO,細(xì)胞凍存要取生長(zhǎng)期旺盛的細(xì)胞,否則復(fù)蘇時(shí)細(xì)胞成活率低。(4)細(xì)胞在復(fù)蘇、傳代、凍存去培養(yǎng)基上清時(shí),一定要輕輕倒掉或用移液管吸掉培養(yǎng)液,過(guò)重、過(guò)快容易把細(xì)胞也去掉。5.間隔時(shí)間,云圖5(1)要經(jīng)常加強(qiáng)細(xì)胞培養(yǎng)人員無(wú)菌觀點(diǎn)的教育。(尤其是本科生和新來(lái)的研究生)在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,每一個(gè)環(huán)節(jié)都要嚴(yán)格按無(wú)菌操作進(jìn)行。在細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、凍存過(guò)程中,培養(yǎng)瓶口都要經(jīng)酒精燈火燒數(shù)秒,手消毒后不要接觸瓶口,要用鑷子。中間離開(kāi)操作臺(tái)要重新消毒。離心后的細(xì)胞去上清吸或倒培養(yǎng)液時(shí)要輕要慢,以避免把細(xì)胞倒出。培養(yǎng)箱要及時(shí)關(guān)上,不要經(jīng)常開(kāi)。(2)細(xì)菌污染的防治。細(xì)菌污染呈黑色細(xì)沙狀,污染小可用慶大霉素50~100u/ml,萬(wàn)古霉素50u/ml,氨卡青霉素50~100ug/ml加入培養(yǎng)液中,次日換液。重度污染只有倒掉。(3)支原體污染的防治。支原體呈淺黑色“泥沙狀”,可影響細(xì)胞的生長(zhǎng),使用卡那霉素50~100ug/ml加入培養(yǎng)液中,次日換液,連續(xù)2周,能控制支原體。如果重度污染只有倒掉。(4)真菌污染及防治。氨卡青霉素50~100ug/ml,慶大霉素50~100u/ml,制霉菌素1.5ug/ml加入培養(yǎng)液中對(duì)霉菌污染的細(xì)胞進(jìn)行大劑量沖擊處理,10小時(shí)后換液,能有效抑制霉菌的污染。6.紫外燈照半小時(shí)以上與細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)關(guān)的人員、物品不能進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室,尤其是無(wú)菌操作臺(tái)、操作臺(tái)上的用具在