干燥方式對葡萄皮渣多酚類物質(zhì)及其抗氧化活性的影響

干燥方式對葡萄皮渣多酚類物質(zhì)及其抗氧化活性的影響

植物多酚具有很強(qiáng)的抗逆性，能夠有效清除體內(nèi)的自由基，抑制脂質(zhì)氧化，保護(hù)身體生物因素。葡萄廢棄物中含有大量以植物多酚為主的生物活性物質(zhì),如白黎蘆醇、酚酸、黃酮、兒茶素、表兒茶素、原花青素等,大量研究表明這些物質(zhì)具有很高的抗氧化活性,具有護(hù)肝解毒、抗菌抗癌、抗過敏、預(yù)防高血壓、皮膚保健及美容等功效。近年來我國葡萄與葡萄酒行業(yè)發(fā)展迅速,葡萄酒生產(chǎn)過程中產(chǎn)生了大量廢棄皮渣。最初這些廢棄物被用作肥料、飼料、燃料,甚至被當(dāng)作垃圾處理,不僅利用率低,而且易造成環(huán)境污染。因此,高效利用釀酒葡萄皮渣對增加經(jīng)濟(jì)效益和減少環(huán)境污染均有重要意義。隨著人們對食品安全的關(guān)注,食品抗氧化劑正逐漸由工業(yè)合成轉(zhuǎn)向天然提取,而葡萄酒工業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的大量皮渣是生產(chǎn)天然抗氧化劑的理想原料,目前已有研究者將葡萄皮渣提取物添加到肉類和食用油脂中的研究被報道。此外,葡萄皮渣還被應(yīng)用于日化、環(huán)保領(lǐng)域,以及被用作木質(zhì)黏合劑和處理污水等。干燥處理能抑制物質(zhì)的呼吸作用以及其他生理作用,減少營養(yǎng)物質(zhì)損失,避免微生物活動,有利于物質(zhì)的保藏。食品等加工行業(yè)常用的干燥方式主要有曬干、凍干、烘干、陰干、微波干燥及真空干燥等。酒廠常采用日曬方式干燥葡萄皮渣以降低成本、提高效率,但有相關(guān)研究顯示冷凍干燥比烘干更有利于減少干燥過程中葡萄果皮酚類物質(zhì)的損失。本實(shí)驗(yàn)擬通過研究不同干燥方式對釀酒葡萄皮渣酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性的影響,為選擇最適宜葡萄皮渣的干燥工藝提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1沒食子酸、1,1,1,1,3-二苯基-2-三硝基苯dpph、p-二甲基氨基-肉桂酸p-dmaca釀酒葡萄皮渣:采自新疆焉耆盆地,為葡萄酒浸漬發(fā)酵完,皮籽分離后洗凈得到。沒食子酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、(+)-兒茶素、蘆丁、p-二甲氨基-肉桂酸(p-DMACA)美國Sigma公司;香草醛、鐵氰化鉀、水楊酸、甲醇(均為分析純)天津市博迪化工有限公司。1.2儀器、例25型超純水制備儀KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)昆山儀器有限公司;RC-5C-PLUS型高速冷凍臺式離心機(jī)美國Kendro公司;UV-1700紫外分光光度計、萬分之一電子天平日本島津公司;ZMQS5001型超純水制備儀美國Millipore公司;HH.W21.600S型電熱恒溫水浴鍋上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。1.3方法1.3.1干燥溫度分布采用日曬干燥、低溫凍干、熱風(fēng)烘干及陰干4種對設(shè)備和條件要求較低的干燥方式,其中日曬干燥、陰干分別在新疆和碩地區(qū)室外和室內(nèi)進(jìn)行,其干燥溫度分別約為28℃和20℃;低溫凍干在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行,溫度為-49℃;考慮到酚類物質(zhì)的熱敏性,熱風(fēng)烘干溫度為(60±1)℃,以防止溫度過高使得酚類物質(zhì)的過多損失,4種方式干燥后用液氮研磨成粉末狀,密封避光保存。1.3.2超聲輔助提取采用超聲輔助法提取,準(zhǔn)確稱取3.00g葡萄皮粉末,用30mL酸化甲醇溶液(1mol/LHCl-MOH-水體積比1:80:19),在100W、25℃功率條件下超聲輔助提取30min,然后8000×g低溫離心15min,收集上清液,重復(fù)2次,合并提取液。1.3.3多酚類物質(zhì)的測定1.3.3.碳酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線測定采用福林-肖卡法。取50μL的提取液,加入2.5mL稀釋10倍的福林肖卡試劑和2mL7.5g/100mL的碳酸鈉溶液,混勻,45℃條件下避光反應(yīng)15min后于765nm波長處比色測定吸光度,每個處理重復(fù)3次,結(jié)果以沒食子酸等價值表示(mg/100g)。標(biāo)準(zhǔn)曲線以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制,其質(zhì)量濃度梯度為0、5、10、15、20、25、30mg/L。1.3.3.樣品價值的測定參照Makris等的方法進(jìn)行。吸取提取液0.1mL,用甲醇稀釋2倍,加入0.4mL蒸餾水,0.03mL5g/100mL的亞硝酸鈉溶液,反應(yīng)5min后加入0.03mL10g/100mL的氯化鋁溶液,振蕩搖勻靜置5min,加入0.2mL1mol/L的碳酸鈉溶液和0.24mL蒸餾水,搖勻,在510nm波長處測定吸光度。以蒸餾水替代提取液作對照。每個處理重復(fù)3次,結(jié)果以蘆丁等價值表示(mg/100g)。標(biāo)準(zhǔn)曲線以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制,其質(zhì)量濃度梯度為0、50、100、150、200、250、300mg/L。1.3.3.數(shù)據(jù)處理及分析采用p-DMACA-鹽酸法進(jìn)行。將提取液稀釋2倍后取0.1mL,加入3mL的0.1%p-DMACA的1mol/L的鹽酸甲醇溶液,充分振蕩混勻后,室溫條件下反應(yīng)10min,在640nm波長處測定吸光度,每個處理重復(fù)3次。結(jié)果以(+)-兒茶素等價值表示(mg/100g)。標(biāo)準(zhǔn)曲線以(+)-兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制,其質(zhì)量濃度梯度為0、12.5、25、50、100、200mg/L。1.3.3.花色苷含量測定葡萄皮渣中總花色苷的測定采用pH示差法。提取液分別用pH1.0的鹽酸-氯化鈉緩沖液及pH4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋20倍,15min后分別在510nm與700nm波長處測定這2種稀釋液的吸光度。最后吸光度(A)通過公式(1)計算。總花色苷含量用矢車菊素-3-葡萄糖苷(CGE,mg/L)表示,并通過公式(2)計算。式中:MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷相對分子質(zhì)量(449);DF為稀釋倍數(shù);ε為摩爾吸光系數(shù)(29600L/(mol·cm));Ve為提取液總體積(0.06L);m為葡萄皮取樣質(zhì)量(3.00g)。1.3.4抗疲勞試驗(yàn)1.3.4.葡萄皮提取物的等值trolox參考江慎華等的方法。DPPH反應(yīng)液的配制:將12.5mgDPPH試劑用甲醇溶解,定容至100mL,配成125mg/L的DPPH母液。使用時稀釋5倍至25mg/L,并且現(xiàn)配現(xiàn)用。移取0.1mL稀釋10倍的提取液,加3.9mLDPPH甲醇溶液,在避光條件下反應(yīng)20min,在515nm波長處測定吸光度,并以相同體積的15%乙醇代替葡萄皮提取液樣品為對照,結(jié)果以Trolox等價值(μmolTrolox/g)表示。標(biāo)準(zhǔn)曲線以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制,其質(zhì)量濃度梯度為0、20、40、60、80、100mg/L。1.3.4.鐵氰化鉀的制備參考韓林等的方法進(jìn)行。取0.1mL提取液,依次加入2.5mL0.2mol/L磷酸二氫鈉-磷酸一氫鈉緩沖液(pH6.6)、2.5mL1g/100mL鐵氰化鉀溶液,混勻后置于50℃水浴鍋中反應(yīng)20min,取出快速放入冰水浴中冷卻5min,再加入2.5mL10g/100mL三氯乙酸溶液混勻,于6000×g離心10min。吸取1mL上清液,并依次加入2.5mL去離子水,0.5mL0.1g/100mL三氯化鐵溶液,混勻,反應(yīng)5min后于700nm波長處測定吸光度?？寡趸钚源笮∮晌舛确从?吸光度越大表示抗氧化能力越強(qiáng)。1.4處理數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用MicrosoftExcel2010處理,用IBMSPSSStatistics19.0進(jìn)行分析。2結(jié)果與分析2.1干燥方式和時間的影響由表1可知,葡萄皮渣相對含水量為:烘干<曬干<陰干<凍干,除凍干和陰干外,不同干燥方式間有極顯著差異(P<0.01);而干燥時間也有相同的趨勢,即烘干<曬干<陰干<凍干,且相互間差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。這是由于溫度越高,水分運(yùn)動越劇烈,有利于水分散失,使得葡萄皮渣含水量越低,所需干燥時間越短。2.2不同干燥方式葡萄皮渣的理化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)測得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0174x+0.0089(R2=0.997)。由圖1可知,4種干燥方式處理的葡萄皮渣,其總酚含量大小順序?yàn)?烘干>曬干>陰干>凍干,且不同干燥方式之間都存在極顯著差異(P<0.01)。其中烘干樣品總酚含量為88.84mg/100g,而干燥條件更為溫和的陰干和低溫凍干卻分別只有71.45、47.63mg/100g,這可能是由于多酚氧化酶的作用。Jang等認(rèn)為多酚氧化酶(PPO)在室溫條件下最為活躍,而在溫度較高時其活性受到抑制,溫度高于70℃時甚至?xí)Щ睢abriela等通過研究發(fā)現(xiàn)葡萄多酚氧化酶活性在25℃時最大,并隨溫度增高而逐漸下降;而其穩(wěn)定性隨溫度增高而下降。熱風(fēng)烘干和曬干溫度分別為(60±1)℃和28℃,較高的溫度使得多酚氧化酶活性降低,從而使得皮渣酚類物質(zhì)損失較少;陰干過程中葡萄皮渣中多酚物質(zhì)在多酚氧化酶作用下?lián)p失較多,而凍干過程中多酚氧化酶在低溫條件下較為穩(wěn)定,雖然其活性在低溫下受到抑制,但凍干結(jié)束后的回溫過程其活性得以增強(qiáng),從而造成皮渣多酚物質(zhì)的損失。此外,干燥時間對皮渣多酚化合物含量產(chǎn)生直接影響。這是由于在干燥過程中,葡萄皮渣與氧氣充分接觸,多酚氧化酶對多酚化合物的氧化起催化作用,干燥時間越長,多酚氧化酶作用時間也越長,多酚化合物因氧化損失也就越多。由圖2可知,不同干燥方式的葡萄皮渣總類黃酮含量大小依次為:曬干>烘干>陰干>凍干,最高值為403.56mg/100g,最低值為111.78mg/100g,4種干燥方式間均存在極顯著差異(P<0.01)。類黃酮包括花青素、黃酮醇、黃烷醇及原花青素等,是葡萄果皮中含量較多的一類酚類化合物,與其他酚類化合物一樣,類黃酮對溫度也比較敏感。研究表明高溫(45℃)條件下長時間存放均會使總類黃酮含量減少,但短時間的高溫處理對總酚和總類黃酮含量影響較小。與總酚情況類似,烘干和曬干的葡萄皮渣,因?yàn)闇囟容^高、干燥較快,能有效抑制相關(guān)酶的活性和降低其穩(wěn)定性,減少其作用時間,使得總類黃酮含量較陰干和凍干處理的多;而高溫可能在一定程度上使類黃酮分解,使得曬干處理的總類黃酮含量較烘干處理多。陰干和凍干的葡萄皮渣干燥時間太久,所以總酚和總類黃酮含量都要低。由圖3可知,不同干燥處理的葡萄皮渣中,烘干處理的樣品總黃烷-3-醇含量最高,達(dá)276.15mg/100g;然后依次為曬干、陰干、凍干,其中凍干處理最低,為105.82mg/100g,且4種干燥方式間均存在極顯著差異(P<0.01)。與總酚含量測定結(jié)果相同,不同干燥條件下多酚氧化酶的活性和穩(wěn)定性差異以及作用時間的不同是導(dǎo)致該結(jié)果的重要原因。由圖4可知,烘干處理的葡萄皮渣總花色苷含量最高為5.95mg/g,其次為凍干、曬干、陰干,含量分別為4.78、4.37、4.15mg/g,相互間均存在極顯著差異(P<0.01)?；ㄉ沾罅看嬖谟谄咸压ぶ?是葡萄重要的呈色物質(zhì)。花色苷穩(wěn)定性較差,受pH值、氧氣、酶、光及溫度等因素影響。溫度對花色苷影響非常大。首先,溫度影響花色苷的熱穩(wěn)定性,研究表明在高溫和貯存過程中花色苷會不斷降解;其次,溫度可以通過控制酶活性來影響花色苷含量。烘干過程溫度較高,會導(dǎo)致花色苷熱分解,但所需干燥時間較少,從而在一定程度上減少了花色苷的損失;且高溫有助于抑制相關(guān)酶的活性,有效防止了花色苷因酶催化降解,因而其花色苷含量最高。凍干處理雖溫度低能避免花色苷受熱分解,但其干燥過程緩慢,可能使得酶作用時間較長使得花色苷損失較多;除較高溫度的作用外,光也能加速花色苷的降解,因此曬干處理的皮渣較凍干的花色苷含量低;適宜酶作用的溫度及較長的干燥時間使得陰干處理的花色苷最少。2.3葡萄皮渣的抗氧化活性DPPH自由基清除能力是常見的評價抗氧化能力的指標(biāo),與總酚含量呈正相關(guān),并與總抗氧化能力也有很強(qiáng)的相關(guān)性。由圖5可知,4種干燥方式處理的葡萄皮渣的DPPH自由基清除能力存在極顯著差異(P<0.01),其中烘干最優(yōu),然后依次為曬干、陰干、凍干處理,這與總酚含量測定結(jié)果一致?？寡趸钚允芊磻?yīng)條件、底物及產(chǎn)物影響,與DPPH自由基清除力相比,鐵氰化鉀還原力從另一個方面反映體系的抗氧化活性。由圖6可知,不同干燥處理葡萄皮渣的鐵氰化鉀還原能力由高到低分別為:烘干>曬干>陰干>凍干,相互間均存在極顯著差異(P<0.01)。該結(jié)果與總酚含量及DPPH自由基清除力相一致。綜合DPPH自由基清除力和鐵氰化鉀還原力情況來看,不同干燥方式的葡萄皮渣抗氧化活性差異顯著,且烘干>曬干>陰干>凍干。2.4總酚含量、dpph自由基清除能力和鐵氰化鉀還原力的相關(guān)性分析由表2可知,除總花色苷含量外,其他各指標(biāo)間均呈正相關(guān),其中總黃烷-3-醇與總酚含量、DPPH自由基清除能力和鐵氰化鉀還原力均呈顯著相關(guān)性(P<0.05),總酚含量與鐵氰化鉀還原力顯著相關(guān)(P<0.05)。表明總酚含量、總