青霉piniciliumspwf-106的抗腫瘤活性次級代謝產物研究

青霉piniciliumspwf-106的抗腫瘤活性次級代謝產物研究

海洋微生物是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。許多研究表明，海洋微生物能夠產生豐富的結構新的、具有顯著生理活性的次代謝產物。目前，海洋微生物已成為廣闊的開發(fā)前景的藥物資源，受到國內外科學家的關注。我們采用人肝癌HepG2細胞系,利用MTT法結合細胞形態(tài)鏡檢,從海洋環(huán)境中尋找抗腫瘤活性菌株,并進行大規(guī)模發(fā)酵,通過活性跟蹤分離純化其抗腫瘤活性次級代謝物。本文對來源于煙臺黃海近海海泥的真菌Penicilliumsp.WF-06的抗腫瘤活性次級代謝產物進行了研究,從其發(fā)酵產物中分離并鑒定了6個單體化合物,分別為GliocladineC(1)、環(huán)-甘氨酰脯氨酸(2)、環(huán)-苯丙氨酰脯氨酸(3)、環(huán)-色氨酰丙氨酸(4)、1,3-二氨基-2-硝基苯(5)和3-羧基吲哚(6),并初步評價了它們對人肝癌HepG2細胞的增殖抑制活性,本文報道這6個化合物的分離純化、結構鑒定及其抗腫瘤活性。1材料和方法1.1儀器、試藥與分析分析用高效液相色譜儀用Waters公司產品(Waters600泵,Waters996二極管陣列檢測器,Millennium32工作站,CapcellPakC18柱:5μm,4.6mm×250mm)。制備用高效液相色譜儀用日本島津公司產品(LC-6AD泵,SPD-M20AVP檢測器,SCL-10AV型系統(tǒng)控制器,CapcellParkC18柱:5μm,20mm×250mm)。質譜用MarinerAPI-TOF型質譜儀。核磁共振譜用JEOLJNM-ECP400型(1HNMR600MHz,13CNMR100MHz)。旋轉蒸發(fā)儀用日本東京理化公司EYELAN-N型。真空濃縮儀用Savant公司SC250DDA型。搖床用上海智城分析儀器制造有限公司ZHWY2102型。分析天平用上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠JA1003N型。柱層析及薄層層析用硅膠H(10～40μm):煙臺化工集團公司;Sephadex?LH-20:Pharmacia公司;LiChroprep?RP-18(25～40μm):Merck公司;順鉑(CDDP):Sigma公司;石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、濃硫酸、乙酸、DMSO等均為分析純;液相用水為Milli-Q超純水,甲醇、乙腈為色譜純。1.2菌株的分離和培養(yǎng)1.2.1壞死性細胞毒活性真菌Penicilliumsp.WF-06采自煙臺黃海沿海海泥,初篩結果顯示壞死性細胞毒活性。菌種特征:菌落表面呈墨綠色,背面顏色稍深,孢子呈淺綠色,孢子生長速度快。菌株固體斜面樣品現(xiàn)保存于北京工商大學植物資源研究開發(fā)北京市重點實驗室。1.2.2發(fā)酵液和液體萃取乙酸乙酯浸膏的制備取該菌株適量,接種到瓊脂固體斜面培養(yǎng)基上,28oC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d,用接種環(huán)取適量孢子和菌體接種到3個500mL錐形瓶中,內含150mL真菌培養(yǎng)液(蛋白胨1%、味精1%、酵母膏0.5%、葡萄糖2%),置于搖床中,在28oC、130r/min條件下培養(yǎng)3d,從而獲得種子培養(yǎng)液。取種子液適量,按5%的接種量到100個500mL錐形瓶中(內含150mL上述培養(yǎng)液),置于搖床中,在與種子相同的發(fā)酵條件下分別發(fā)酵7d,獲得15L發(fā)酵液,用紗布過濾得到發(fā)酵液和菌絲體兩部分。發(fā)酵液減壓濃縮至5L,加入等體積的乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯萃取液,經減壓濃縮得到發(fā)酵液的乙酸乙酯浸膏(4.9g);菌絲體在80%丙酮-水中超聲破碎后取水層,同樣加入等體積的乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯萃取液,經減壓濃縮得到菌絲體的乙酸乙酯浸膏(8.6g);合并兩者共得到乙酸乙酯粗浸膏(13.5g)。1.3惡意程序活性乙酸乙酯粗浸膏(13.5g)經50g硅膠G拌樣,干法上300g硅膠H填裝的減壓柱,石油醚-氯仿-甲醇溶液梯度洗脫,洗脫組分經TLC薄層檢測后合并成7個組分(Fr.1～7),對各組分進行抗腫瘤活性檢測,結果顯示Fr.3(108mg)、Fr.4(245mg)、Fr.6(228mg)具有壞死性細胞毒活性。采用反復正相、反相硅膠柱層析、SephadexLH-20、PTLC及半制備HPLC等分離技術對活性組分進行分離純化。Fr.3在CHCl3-MeOH溶劑系統(tǒng)中重結晶及石油醚-CHCl3梯度洗脫,再經SephadexLH-20在CHCl3-MeOH(1:1體系中)柱層析,得到化合物3(4.0mg);Fr.4先后用CHCl3-MeOH硅膠柱梯度洗脫、再經反復CHCl3-MeOH溶液SephadexLH-20柱層析、HPLC半制備(20%～80%甲醇-水梯度洗脫),得到化合物1(6.6mg)、5(3.0mg)和6(7.2mg);Fr.6經石油醚-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫及CHCl3-MeOH溶液(1:1～2:3)SephadexLH-20柱層析,得到化合物2(3.6mg)和4(4.1mg)。1.4腫瘤細胞酶活性檢測抗腫瘤活性篩選采用人肝癌HepG2細胞系,細胞培養(yǎng)液用含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基,內含有100units/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素,在37oC、通入5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)?？鼓[瘤活性測試采用MTT方法:取對數(shù)生長期的腫瘤細胞,將細胞密度調至每毫升含有2×105個細胞,按每孔200μL接種于96孔細胞培養(yǎng)板中,于37℃通入5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。樣品分別設定5個濃度梯度,每個濃度設3個平行樣,同時設陽性、陰性對照,每孔加樣品液或空白液各2μL,培養(yǎng)24h,然后每孔加MTT溶液10μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h,37℃、2000r/min離心8min,吸去上清。每孔加入DMSO各100μL,在微量振蕩器上振蕩15min,至結晶完全溶解后,酶標儀測定每孔570nm處的吸光值(OD值)。取三孔平均OD值按IR%=(OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照×100%式計算樣品對細胞增殖的抑制率(IR%),并采用bliss法計算出半數(shù)抑制率IC50和標準方差。2結果2.1cnmr-meod的鑒定化合物1,白色結晶(MeOH),碘化鉍鉀顯色反應呈陽性,提示該化合物可能是生物堿類。陽離子ESIMS在m/z465.2處給出準分子離子峰[M+H]+峰,提示分子量為464,結合NMR譜推測分子式為C23H20N4O3S2。1HNMR(600MHz,Acetoned6)δ:10.10(1H,s,H-1′)、8.23(1H,d,J=8.0Hz,H-4′)、7.56(1H,d,J=7.0Hz,H-10)、7.45(1H,s,H-2′)、7.40(1H,d,J=7.7Hz,H-7′)、7.07(1H,m,H-6′)、7.03(1H,m,H-5′)、6.90(1H,t,J=7.0Hz,H-8)、6.68(1H,brd,J=9.5Hz,H-7)、6.65(1H,s,H-11)、6.60(1H,m,H-9)、6.01(1H,s,H-5a)、2.66(3H,s,H-12)、1.69(3H,s,H-13)。13CNMR(150MHz,Acetone-d6)δ:167.3(C-1)、163.0(C-4)、148.6(C-6a)、138.0(C-1′a)、132.9(C-10a)、128.8(C-8)、127.3(C-3′a)、124.6(C-10)、123.8(C-2′)、122.3(C-4′)、122.0(C-6′)、119.6(C-5′)、119.5(C-9)、115.5(C-3′)、112.2(C-7′)、110.9(C-7)、83.2(C-5a)、81.0(C-11)、78.5(C-11a)、74.4(C-3)、62.1(C-10b)、27.5(C-12)、17.6(C-13)。13CNMR和DEPT譜中給出兩個酰胺羰基信號δ167.3(C-1)和163.0(C-4),在δ77.7(C-11a)和74.4(C-3)給出兩個季碳信號,提示分子中可能含有二氧哌嗪骨架結構,結合1H1HCOSY譜可確定分子中含有兩個吲哚環(huán),如圖2所示。在1HNMR低場區(qū)δ6.01(H-5a)和6.65(H-11)處給出兩個連氧或氮的次甲基質子信號,δ2.66處給出氮甲基信號,結合HMQC和HMBC譜,推出各片斷的耦合關系,見圖1,與文獻對照,確定該化合物為GliocladineC,見圖2?；衔?,無定型粉末,[α]D20-14.8(c1.0,MeOH)。該化合物經6mol/LHCl于110℃下水解1h后,茚三酮反應呈陽性,提示化合物2是肽類或環(huán)肽類化合物。陽離子ESIMS在m/z155處給出準分子離子峰[M+H]+峰,提示分子量為154,分子中可能含有偶數(shù)氮,結合NMR譜推測分子式為C7H10N2O2。IR(KBr)γmax3424、3190、3051、2959、2888、1678、1469cm-1,提示分子中可能含有活潑氨基和酰胺基。1HNMR(600MHz,MeOD)δ:4.23(1H,m,H-3)、4.10(1H,d,J=16.8Hz,H-6a)、3.71(1H,d,J=16.8Hz,H-6b)、3.53(2H,m,H-7)、2.31(2H,m,H-9)、1.99(2H,m,H-8)。13CNMR(150MHz,MeOD)δ:172.0(C-4)、166.5(C-1)、59.9(C-3)、46.9(C-6)、46.3(C-7)、29.3(C-9)、23.3(C-8)。13CNMR和DEPT譜給出兩個酰胺羰基信號(δ172.0,C-4;166.5,C-1),1HNMR中δ4.23(1H,m)顯示分子中含有1個連氮的次甲基,δ4.10(1H,d,J=16.8Hz)和δ3.71(1H,d,J=16.8Hz)為同碳上的氫,并與羰基、氨基相連,提示該化合物可能是環(huán)二肽類化合物,并含有甘氨酸殘基,與文獻對照,確定該化合物為環(huán)-甘氨酰脯氨酸[cyclo-(Gly-Pro)],見圖2?；衔?,白色無定型粉末,該化合物經6mol/LHCl于110℃下水解1h后,茚三酮反應呈陽性,提示化合物3也是肽類或環(huán)肽類化合物。陽離子ESIMS顯示其分子量為244,分子中可能含有偶數(shù)氮,結合NMR確定分子式為C9H16N2O2。1HNMR(600MHz,MeOD)δ:7.29(2H,dd,J=7.7,1.0Hz,H-2′,H-6′)、7.26(2H,brt,J=7.7Hz,H-3′,H-5′)、7.20(1H,brt,J=7.7Hz,H-4′)、4.43(1H,t,J=4.2Hz,H-2)、4.05(1H,dd,J=6.6Hz,H-5)、3.53(1H,m,H-2aa)、3.30(1H,m,H-2ab)、3.15(2H,m,H-7)、2.08(1H,m,H-9a)、1.79(2H,m,H-8)、1.22(1H,m,H-9b)。1HNMR譜給出15個氫,低場區(qū)δ7.29-7.20有5個芳香氫,提示有一單取代苯環(huán);δ4.43(1H,brs)和δ4.06(1H,m)可能是連氮的2個次甲基氫,提示該化合物為環(huán)二肽。δ3.53(1H,m)和δ3.30(1H,m)是芐基兩質子信號,δ3.15(2H,m)、δ2.08(1H,m)、δ1.79(2H,m)和1.22(1H,m)可能是吡咯環(huán)亞甲基氫信號,且分子中無甲基峰,與文獻對照,分析該化合物為環(huán)-苯丙氨酰脯氨酸[cyclo-(Phe-Pro)]?；衔?,白色結晶(MeOH),該化合物經6mol/LHCl于110℃下水解1h后,茚三酮反應呈陽性,提示化合物3也是環(huán)肽類化合物。陰離子ESIMS在m/z256.3處給出分子離子峰[M-H]-峰,提示分子量為257,分子中可能含有奇數(shù)氮,結合NMR譜推測分子式為C14H15N3O2。1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ:10.89(1H,brs,NH-1′)、8.02(1H,brs,NH-2)、7.90(1H,brs,NH-5)、7.56(1H,d,J=8.0Hz,H-5′)、7.30(1H,d,J=8.0Hz,H-8′)、7.04(1H,s,H-2′)、7.02(1H,dt,J=0.8,7.3,8.0Hz,H-6′)、6.93(1H,dt,J=0.8,7.3,8.0Hz,H-7′)、4.11(1H,dd,J=4.0,4.6Hz,H-3)、3.58(1H,q,J=7.0Hz,H-6)、3.24(1H,dd,J=4.6,14.3Hz,H-3aa)、3.01(1H,dd,J=4.6,14.3Hz,H-3ab)、0.42(3H,d,J=7.0Hz,H-6a)。13CNMR(150MHz,DMSO-d6)δ:167.7(C-1)、166.7(C-4)、135.8(C-9′)、127.8(C-4′)、124.5(C-2′)、120.8(C-6′)、118.9(C-5′)、118.4(C-7′)、111.1(C-8′)、108.5(C-3′)、55.4(C-3)、49.8(C-6)、28.8(C-3a)、19.5(C-6a)。綜合以上信息并與文獻對照,確定該化合物為環(huán)-色氨酰丙氨酸[cyclo-(TrpAla)],見圖2?；衔?,淡紅色無定形粉末,陰離子ESIMS在m/z152.1處給出準分子離子峰[M-H]-峰,提示分子量為151,結合NMR譜推測分子式為C6H7N3O2。IR(KBr)γmax3444、3300、1334、1617、1542cm-1,提示分子中可能含有氨基、硝基和苯環(huán)。1HNMR(600MHz,MeOD)δ:7.34(1H,dd,J=1.4,8.9Hz,H-6)、6.79(1H,dd,J=1.4,7.7Hz,H-4)、6.44(1H,dd,J=7.7,8.9Hz,H-5)。13CNMR(150MHz,MeOD)δ:146.2(C-1)、142.1(C-3)、112.0(C-2)、123.2(C-6)、117.9(C-4)、116.1(C-5)。結合DEPT譜并參考文獻,確定該化合物為1,3-二氨基-2-硝基苯(1,3-diamino-2-nirtobenzene),見圖2?；衔?,白色片狀晶體(MeOH),陰離子ESIMS在m/z160.2給出準分子離子峰[M-H]-峰,提示分子量為161,結合NMR譜推測分子式為C9H7NO2。1HNMR(600MHz,MeOD)δ:8.04(1H,d,J=8.7Hz,H-9)、7.94(1H,d,J=5.1Hz,H-2)、7.42(1H,d,J=7.0Hz,H-6)、7.19(1H,m,H-7)、7.16(1H,m,H-8)。13CNMR(150MHz,MeOD)δ:169.1(C-10)、138.2(C-5)、133.4(C-2)、127.5(C-4)、123.6(C-7)、122.4(C-8)、122.0(C-9)、112.9(C-6)、108.7(C-3)。結合DEPT譜并與文獻對照,鑒定該化合物為3-羧基吲哚(1H-indole-3-carboxylicacid),見圖2。2.2mtt法檢測細胞增殖抑制活性以人肝癌HepG2細胞為抗腫瘤活性篩選靶細胞,采用細胞形態(tài)鏡檢和MTT法在細胞水平上初步評價化合物1、2、3、4、5和6的抗腫瘤活性。HepG2細胞經濃度為10.0μmol/L化合物