鎖陽多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及單糖組成分析

鎖陽多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及單糖組成分析

香陽是多年生草本植物香陽的肉枝。它喜生在沙漠和草地上的干旱或堿性沙地上，通常生長(zhǎng)在刺的根部。鎖陽具有補(bǔ)腎陽、益精血、潤(rùn)腸通便和提高免疫力的功效,在民間常作為食物蒸食,也作為補(bǔ)藥廣泛使用。研究發(fā)現(xiàn)多糖類物質(zhì)有可能是鎖陽重要的有效成分。近年來,盡管鎖陽逐漸受到了醫(yī)藥界的廣泛關(guān)注,但與其他的植物多糖相比,鎖陽多糖的研究并不廣泛?，F(xiàn)有的研究也多以粗糖的提取工藝、藥理活性為主,對(duì)鎖陽多糖結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道極少。本工作從具有抗氧化活性的鎖陽多糖復(fù)合物中分離出2個(gè)多糖組分,本文僅對(duì)其中得到的新的可溶性多糖(PolysaccharideisolatedfromCynomoriumsongaricumRupr.,CSP-D1)的理化性質(zhì)、單糖組成等的研究進(jìn)行報(bào)道,為鎖陽藥用資源的研究開發(fā)及植物多糖的研究應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)參考。1材料和方法1.1osede-65鎖陽購(gòu)自甘肅省黃河藥材市場(chǎng)。DEAE-纖維素柱填料為CelluloseDE-52(solarbio);木瓜蛋白酶(sigma)、各種標(biāo)準(zhǔn)單糖、D-半乳糖醛酸(sigma)、H2O2、CHCl3、正丁醇、咔唑、乙酸酐、吡啶等其他試劑均為分析純:天津化學(xué)試劑一廠。1.2紅外光譜及儀器HL-2恒流泵、BSZ-100自動(dòng)收集器:上海青浦滬西儀器廠;GPC2000高溫凝膠滲透色譜儀:美國(guó)waters公司;FTS3000型傅里葉紅外光譜儀:美國(guó)PE公司;GC-MS聯(lián)用儀[配有HP-5(30m×0.25mm×0.25μm)彈性石英毛細(xì)管柱及美國(guó)NIST02L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)]:美國(guó)安捷倫公司;UV1100紫外分光光度計(jì):北京萊伯泰科科技有限公司;DT-40TG-DTA熱分析系統(tǒng):日本島津。1.3方法1.3.1鎖陽精多糖的純化鎖陽多糖的提取:鎖陽低溫真空烘干后,粉碎,100目過篩。70%乙醇浸泡粉末除脂,熱水浸提,濾液濃縮后乙醇沉淀,離心收集沉淀,冷凍干燥得鎖陽粗多糖。粗多糖用木瓜蛋白酶和sevag法脫蛋白,H2O2法脫色得到鎖陽精多糖。鎖陽多糖CSP-D1的純化(采用DEAE-纖維素柱純化):100gCelluloseDE-52,蒸餾水浸泡,再用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl溶液處理30min,抽干后用蒸餾水洗滌至中性。用磷酸緩沖液處理后裝柱(1.6cm×51cm)。分別用蒸餾水及0～0.2mol/L的NaOH進(jìn)行梯度洗脫,恒流泵控制流速為0.6mL/min,自動(dòng)收集器收集,每管收集8min,隔管苯酚硫酸法于A490檢測(cè)糖分布。1.3.2nm:socl利益測(cè)定條件為L(zhǎng)aserwavelength:690.0nm;Solvent:water;Flowrate:0.500mL/min。1.3.3紅外吸收光譜法的測(cè)定樣品KBr壓片處理,于400nm-1～4000nm-1波長(zhǎng)掃描。1.3.4標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生化反應(yīng)色譜柱:HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm);升溫程序:160℃保持3min,以2℃/min程序升溫升至210℃,保持1min;檢測(cè)器溫度:250℃;進(jìn)樣口溫度:250℃;載氣(N2)流速1.0mL/min,進(jìn)樣量0.2μL;分流比:50mL/min。完全酸水解及衍生化:10mg多糖加入4mol/L三乙氟酸(TFA)4mL,120℃氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng)10h,產(chǎn)物蒸干后加入40mg鹽酸羥銨,2mL吡啶,90℃反應(yīng)30min得到乙酰化產(chǎn)物。標(biāo)準(zhǔn)單糖同樣做衍生化處理。減壓蒸干乙?；a(chǎn)物,氯仿溶解后進(jìn)行GC-MS分析,并根據(jù)氣質(zhì)各峰的面積比算出百分含量。1.3.5tg-ta分析取CSP-D1粉末2mg左右,參比物為Al2O3,氣氛為氮?dú)?升溫速率:10℃/min,升溫范圍:25℃～750℃。1.3.6最佳波長(zhǎng)的確定糖醛酸含量的測(cè)定:以半乳糖醛酸為對(duì)照品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(溶液濃度范圍為10μg/mL～100μg/mL),采用咔唑法,依照文獻(xiàn)處理后使用紫外分光光度計(jì)在400nm～800nm掃描(以蒸餾水同法操作為參比)得最佳波長(zhǎng)為526nm。取CSP-D1溶液0.1mL,同時(shí)做3個(gè)重復(fù),按標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定法分別測(cè)定其吸光值,并利用線性回歸方程計(jì)算糖醛酸含量。2結(jié)果與分析2.1充填的峰形及分子量鎖陽多糖經(jīng)過CelluloseDE-52(1.6×51cm)柱層析,用苯酚硫酸法測(cè)定洗脫曲線如圖1。由圖1可知,用蒸餾水洗脫時(shí)可得1種組分,NaOH進(jìn)行梯度洗脫得另一組分。峰一收集得到的鎖陽多糖命名為CSP-D1,此組分峰形對(duì)稱。峰二的峰形較峰一偏斜程度大,本文僅做峰一的研究。CSP-D1干燥后粉末為淺黃色,易溶于水,如圖2,GPC測(cè)得其分子量(Mn)為5.5×104。從GPC激光檢測(cè)得到的響應(yīng)曲線可見其峰形對(duì)稱,表明組分均一。2.2gc-ms分析圖3為CSP-D1的紅外光譜圖。3398.57cm-1的-OH吸收峰,2932.25cm-1的C-H伸縮振動(dòng)峰以及1400cm-1～1200cm-1左右的C-H變角振動(dòng)峰都是糖類化合物的特征吸收峰;1615.77cm-1～1442.09cm-1處的吸收峰為C=O振動(dòng)峰和C-H彎曲振動(dòng)峰;875cm-1為β-D吡喃葡萄糖的特征吸收峰。以常見的8種標(biāo)準(zhǔn)單糖做對(duì)照,以逐一進(jìn)樣與混合進(jìn)樣的方法,確定每種單糖的出峰時(shí)間,得到GC-MS單糖標(biāo)準(zhǔn)圖譜,如圖4。圖5為CSP-D1的GC-MS圖譜,根據(jù)各色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時(shí)間的對(duì)照見表1。由以上圖表可知,CSP-D1的色譜峰依次為鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。各組成含量表明,其主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖組成,并含有少量的鼠李糖。其中保留時(shí)間為11.14min的峰經(jīng)GC-MS數(shù)據(jù)庫(kù)檢索由非糖物質(zhì)形成,此峰在標(biāo)準(zhǔn)糖圖譜中同樣存在。與已有的文獻(xiàn)報(bào)道不同,鎖陽多糖單糖組成中并不含核糖,此外,含量最多的不是半乳糖而是葡萄糖。推測(cè)以上結(jié)果差異是由以下原因造成的:1)材料、提取純化以及測(cè)定方法的差異都可能導(dǎo)致文獻(xiàn)與本研究中的鎖陽多糖為結(jié)構(gòu)不同的糖;2)文獻(xiàn)中的核糖是含量最少的組分,其存在與否與多糖純度及儀器的靈敏度緊密相關(guān),即使材料中存在少量核酸,都有可能在單糖組成分析時(shí)出現(xiàn)核糖。圖6(A、B)中分別為CSP-D1的DTA以及TG曲線。由圖6A可知,CSP-D1的分解反應(yīng)主要集中在290℃～520℃,分多步發(fā)生。100℃以下的失重由吸附水分的蒸發(fā)引起,之后的失重為多糖本身的分解。其結(jié)果分析見表2、3。從圖6B可知,CSP-D1的起始分解溫度為206.9℃,外推始點(diǎn)277.8℃。2.3糖醛酸含量的測(cè)定按照1.3.5方法,對(duì)樣品中糖醛酸含量進(jìn)行測(cè)定,得出CSP-D1中的糖醛酸含量為27.9%,與文獻(xiàn)中報(bào)道的兩種鎖陽多糖的糖醛酸含量相比,平均高出了17.3%。3酸性雜多糖的結(jié)構(gòu)及特性1)鎖陽經(jīng)水提醇沉分離、脫蛋白脫色后,柱層析可以得到組分均一,分子量為5.5×104的CSP-D1多糖。2)鎖陽多糖CSP-D1是含糖醛酸(其糖醛酸種類目前還不確定)27.9%的酸性雜多糖,其單糖組成為:鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖,其中含量最多的糖為葡萄糖,其次為半乳糖。百分含量分別為44