疾病相關(guān)基因功能研究的方法與策略課件

疾病相關(guān)基因功能研究的方法與策略疾病相關(guān)基因簡介12疾病相關(guān)基因的研究內(nèi)容34研究方法與策略疾病相關(guān)基因的鑒定內(nèi)

容

概

要5實例列舉2疾病相關(guān)基因簡介12疾病相關(guān)基因的研究內(nèi)容34研究方法與策略疾病相關(guān)基因的鑒定內(nèi)

容

概

要5實例列舉3目錄疾病相關(guān)基因是醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)最重要的領(lǐng)域。幾乎所有疾病都與基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)變化有關(guān)，是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。疾病相關(guān)基因致病基因：一種疾病的表型和一個基因型呈直接對應(yīng)的因果關(guān)系，即該基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)的異常是導(dǎo)致該病發(fā)生的直接原因疾病易感基因：環(huán)境因素和遺傳因素均起著一定作用，表現(xiàn)為2個以上基因的“微效作用”的相加，或者多基因間的相互作用，而單一基因變異僅增加對疾病的易感性疾病相關(guān)基因疾病相關(guān)基因舉例：人血紅蛋白功能56正常紅細(xì)胞鐮刀（Sickle）形紅細(xì)胞疾病相關(guān)基因N-val

·his

· leu·thr

·pro

· glu·glu

·····N-val

·his

· leu·thr·pro

· val·glu

·····鐮刀形紅細(xì)胞貧血?。篏A

GGT

G7C(146)

HbAC(146)

HbS鐮刀（Sickle）疾病相關(guān)基因分子病（molecular

disease）

：

Gene突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子質(zhì)和量異常，從而引起機體功能障礙的一類疾病，稱為分子病。

鏈第6位谷氨酸被纈氨酸取代，形成HbS（鐮狀Hb)。在缺氧情況下，HbS聚合形成長棒狀聚合物，使紅細(xì)胞鐮變，變形能力低，導(dǎo)致溶血、貧血，引起血粘度增高，血管梗阻性繼發(fā)癥狀。8疾病相關(guān)基因Nature16September2009doi:10.1038/news.2009.921Colourblindnesscorrectedbygene

therapy

Treatedmonkeyscannowseein

technicolour.疾病相關(guān)基因10疾病相關(guān)基因簡介12疾病相關(guān)基因的研究內(nèi)容34研究方法與策略疾病相關(guān)基因的鑒定內(nèi)

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要5實例列舉一、鑒定疾病相關(guān)基因的關(guān)鍵是確定疾病表型和基因間的實質(zhì)聯(lián)系目錄正確的診斷是鑒定疾病基因的先決條件確定疾病的遺傳因素，即通過孿生子分析，領(lǐng)養(yǎng)分析和同胞罹患率分析等確定遺傳因素是否在疾病發(fā)病中的作用及其作用程度。（一）從已知蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)出發(fā)克隆疾病基因目錄功能克?。╢unctional

cloning）采用的是從蛋白質(zhì)到DNA的研究路線，針對的是一些對影響疾病的功能蛋白具有一定了解的疾病。依據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息鑒定克隆疾病相關(guān)基因用蛋白質(zhì)的特異性抗體鑒定疾病基因（二）從疾病的表型差異出發(fā)發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因目錄表型克?。╬henotype

cloning）基于對疾病表型和基因結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)的特征聯(lián)系已經(jīng)有所認(rèn)識的基礎(chǔ)上來分離鑒定疾病相關(guān)基因。比較患者基因組DNA與正常人基因組DNA的不同，直接對產(chǎn)生變異的DNA片段進(jìn)行克隆，而不需要基因的染色體位置或基因產(chǎn)物的其他信息。（三）采用動物模型鑒定克隆疾病相關(guān)基因目錄人類的部分疾病，已經(jīng)有相應(yīng)的動物模型。如果動物某種表型的突變基因定位于染色體的某一部位,

而具有相似人類疾病表型的基因很有可能存在于人染色體的同源部位。另外，當(dāng)疾病基因在動物模型上已完成鑒定，還可以采用熒光原位雜交來定位分離人的同源基因。熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence

insituhybridization,

FISH)檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析目錄HER2人類表皮生長因子受體2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2,HER2)二.

鑒定疾病相關(guān)基因需要多學(xué)科多途徑的綜合策略目錄疾病相關(guān)基因鑒定克隆策略示意圖疾病相關(guān)基因的鑒定基因診斷*

(gene

diagnosis)

是以DNA或RNA為材料，檢測基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平是否異常，從而對疾病作出診斷的方法?；具^程:分離、擴增待測的DNA/RNA片斷區(qū)分或鑒定DNA/RNA的異常目錄目錄20疾病相關(guān)基因簡介12疾病相關(guān)基因的研究內(nèi)容34研究方法與策略疾病相關(guān)基因的鑒定內(nèi)

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要5實例列舉基因的功能實際是基因產(chǎn)物的功能，即編碼基因的蛋白質(zhì)功能和非編碼基因RNA的功能。目錄基因產(chǎn)物之一蛋白質(zhì)的功能可從三個不同水平來描述：①

生化水平，主要描述基因產(chǎn)物參與了何種生化過程，如屬于激酶、轉(zhuǎn)錄因子等② 細(xì)胞水平, 主要論述基因產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的定位和參與的生物學(xué)途徑，例如，某蛋白質(zhì)定位于核內(nèi)，參與DNA的修復(fù)過程等③

整體水平,

主要包括基團(tuán)表達(dá)的時空性及基因在疾病中的作用一、基因比對及功能詮釋目錄常用的兩大雙序列比對工具是BLAST

和FASTA,分別由美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）和歐洲生物信息學(xué)研究所（EBI）開發(fā)和維護(hù)。NCBI的主頁是/；EBI的主頁是http://www.ebi.ac.uk/。二、利用工程細(xì)胞研究基因功能目錄（一）采用基因重組技術(shù)建立基因高表達(dá)工程細(xì)胞系（二）基因沉默技術(shù)抑制特異基因的表達(dá)三、利用基因修飾動物整體研究基因功能目錄盡管在體外對基因功能的研究可提供大量信息，但是只有在整體內(nèi)的研究才能真實反映該基因在體內(nèi)的真正作用。通過在實驗動物，持別是小鼠體內(nèi)進(jìn)行相關(guān)的基因操作，獲得基因修飾動物品系，已成為在體研究基因功能的重要手段，常用的有轉(zhuǎn)基因動物和基因敲除動物。四、研究生物大分子間的相互作用可確定基因功能目錄在一些情況下,

即使對基因的序列、結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式有清楚的認(rèn)識，但仍然難以闡明基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能。此時通過研究該蛋白質(zhì)與已知功能蛋白質(zhì)的相互作用，無疑將非常有助于對該蛋白質(zhì)功能的了解。常用的高通量篩查蛋白質(zhì)間相互作用的方法是酵母雙雜交技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)。FunctionalAnalysisof

Genes目錄Sequenceandstructure

analysisExpression

profilingCellularcompartmentalizationGain-of-functionLoss-of-functionProtein-protein

interactionUpstream

cuesDownstream

effects疾病相關(guān)基因簡介12疾病相關(guān)基因的研究內(nèi)容34研究方法與策略疾病相關(guān)基因的鑒定內(nèi)

容

概

要527實例列舉疾病研究歷程28疾病相關(guān)基因研究策略“我有一個Topic，你能幫我

Make

Story嗎？”29疾病相關(guān)基因研究背景—— 想做什么，能不能做，如何去做30數(shù)據(jù)集成的哲學(xué)基礎(chǔ)“我們所觀測到的不是自然本身，而是自然根據(jù)我們探索它的方法的展現(xiàn)”——維爾納·海森堡

(“測不準(zhǔn)原理”,

量子力學(xué)，1932年諾貝爾物理學(xué)獎)31數(shù)據(jù)集成的哲學(xué)基礎(chǔ)“我們所觀測到的不是自然本身，而是自然根據(jù)我們探索它的方法的展現(xiàn)”——維爾納·海森堡

(“測不準(zhǔn)原理”,

量子力學(xué)，1932年諾貝爾物理學(xué)獎)32多維組學(xué)數(shù)據(jù)整合的案例TCGA(The

Cancer

GenomeAtlas,

NIH),涉及到6個層次的組學(xué)數(shù)據(jù)33以TCGA數(shù)據(jù)集成為例??集成了多達(dá)7種組學(xué)數(shù)據(jù)（如SNPs,

Copy

number,

DNA

methylation,Geneexpression,microRNAsexpression

etc.)各種組學(xué)數(shù)據(jù)均可與臨床預(yù)后信息建立相關(guān)性將各種組學(xué)變化映射到pathway或基因網(wǎng)絡(luò)集成基因拷貝數(shù)、基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)癌癥的驅(qū)動因素（driver

genes）Step

1:

選定某個疾病領(lǐng)域中特定topic，如”我是做腎癌的，最近關(guān)注microRNAs，考慮從

autophagy（自噬）角度做點東西”Step2:

通過系統(tǒng)集成

的

TCGA

腎

癌中>200例病人的

mRNAs

+microRNAs

+

臨床預(yù)后數(shù)據(jù)），利用Nature上發(fā)表的方法原理，預(yù)測出通過自噬autophagy影響癌癥預(yù)后的microRNAs

及其靶基因Step

3:

通過細(xì)胞實驗驗證上述microRNAs對自噬的調(diào)控作用36“我有一個Topic，你能幫我

Make

Story嗎？”疾病相關(guān)基因研究策略37檢測指標(biāo)分類1、細(xì)胞行為指標(biāo)。(增殖、凋亡、侵襲遷移、電生理、分化等)2、分子指標(biāo)。（

P53、EMT、Ki67等）

疾病相關(guān)基因研究策略—— 想做什么，能不能做，如何去做確定細(xì)胞模型及檢測指標(biāo)原則1、細(xì)胞及檢測指標(biāo)與研究的臨床問題相符。2、課題組具有可操作性。方法1、查高分文獻(xiàn)。2、請教該領(lǐng)域?qū)＜摇?8疾病相關(guān)基因研究策略—— 想做什么，能不能做，如何去做

確定動物模型及檢測指標(biāo)1、免疫缺陷鼠(

裸鼠、SCID)2、轉(zhuǎn)基因小鼠3、基因敲除小鼠39腫瘤分子生物學(xué)常用實驗動物Nude

Mouse，簡稱裸鼠NOD/SCID、beige

SCID(non-obesediabetic/servercombined

immunodeficiency)40臨床科研課題研究內(nèi)容A基因通過調(diào)控B信號通路影響C疾病的D功能臨床相關(guān)性研究:

A--C組織水平：臨床組織樣本基因的表達(dá)情況臨床深度：基因表達(dá)水平與各種臨床特點（惡性程度，轉(zhuǎn)移與否，耐藥性，生存率等）的相關(guān)性功能研究:

A--D細(xì)胞水平：增殖，凋亡，轉(zhuǎn)移，侵潤，血管新生，耐藥動物水平：成瘤，轉(zhuǎn)移，藥物敏感3.

機制研究:

A--B分子水平：相互結(jié)合，表達(dá)調(diào)控，翻譯后修飾前，降解調(diào)控，剪切調(diào)控，胞內(nèi)定位，激酶信號傳導(dǎo)等41臨床科研課題成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)A基因需具備三個性質(zhì)：1、創(chuàng)新性在所研究的臨床問題中首次報道。Gene

and

disease

到PubMed查詢。有和無。有功能的新基因（狹義）：臨床單位研究目標(biāo)。調(diào)控蛋白編碼基因的廣義“基因”，microRNA，

lncRNA，表觀遺傳學(xué)：科學(xué)院所研究目標(biāo)。2、臨床相關(guān)性在臨床樣品上存在差異。表達(dá)差異、突變、修飾等3、功能在細(xì)胞及動物上，具備功能，且功能與臨床問題一致。科研課題提升的路徑機制研究三個大類：1、分子相關(guān)性上下游信號通路檢測。

A基因改變后，下游信號通路B如何改變。2、功能相關(guān)性a、A干擾后，B下降，細(xì)胞有功能表型。那么單獨把B干擾，功能表型是否跟A干擾一致。b、A干擾后，B下降，細(xì)胞有功能表型。那么在A干擾的前提下，把B過表達(dá)，看細(xì)胞表型是否恢復(fù)。3、直接互作Yeast

two

hybridization、GST

pull-down、Co-IP、EMSA、ChIP。42臨床科研課題做好需要的四個元素發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新的功能基因臨床相關(guān)性基因功能機制探索43如何尋找一個功能基因A文獻(xiàn)調(diào)研基因芯片功能基因A移植研究創(chuàng)新度差不一定成功44蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(protein

chip)*是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。蛋白質(zhì)芯片作用原理蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)47~30000個基因表達(dá)譜芯片數(shù)百~數(shù)千個表達(dá)差異個基因芯片下游的工作簡單數(shù)據(jù)分析數(shù)十到數(shù)百個

基因常規(guī)生物信息學(xué)分析（大

部分芯片

服務(wù)公司

能提供的

服務(wù)）找不到新基因，更找不到新功能基因20~30個基因功能基因（10%）功能學(xué)驗證個性化的生物信息學(xué)與文獻(xiàn)分析目錄FunctionalAnalysisof

GenesSequenceandstructure

analysisExpression

profilingCellularcompartmentalizationGain-of-functionLoss-of-functionProtein-protein

interactionUpstream

cuesDownstream

effects臨床科研課題做好需要的四個元素發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新的功能基因臨床相關(guān)性基因功能機制探索49機制探

索機制研究三個大類：1、分子相關(guān)性上下游信號通路檢測。

A基因改變后，下游信號通路B如何改變。2、功能相關(guān)性a、A干擾后，B下降，細(xì)胞有功能表型。那么單獨把B干擾，功能表型是否跟A干擾一致。b、A干擾后，B下降，細(xì)胞有功能表型。那么在A干擾的前提下，把B過表達(dá)，看細(xì)胞表型是否恢復(fù)。3、直接互作Yeast

two

hybridization、GST

pull-down、Co-IP、EMSA、ChIP。50一、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)