鹽酸米托脂質體的制備及抗腫瘤作用研究

鹽酸米托脂質體的制備及抗腫瘤作用研究

鹽酸米托是一種環(huán)類廣譜抗腫瘤藥物。其作用機制是在dna堿基之間嵌入二甲基，阻止dna的合成和復制，導致dna鏈的連接和結構破壞。此外米托蒽醌還能夠干擾RNA的合成,并且還是拓撲異構酶Ⅱ的有效抑制劑,從而導致基因組DNA的崩解。米托蒽醌屬于細胞周期非特異性藥物,其對腫瘤細胞沒有選擇性,因此具有明顯的毒性,其中最為嚴重的是心臟毒性。在臨床使用過程中,其心臟毒性隨著累積劑量的增加而增大,患者在治療過程中或治療結束數(shù)月或數(shù)年后都有可能發(fā)生充血性心力衰竭。脂質體作為抗腫瘤藥物的載體,可以減少藥物在正常組織的分布,增加藥物在腫瘤組織的蓄積,從而降低藥物毒性、改善藥物的治療指數(shù)。為了提高米托蒽醌的治療指數(shù),許多研究小組試圖開發(fā)其脂質體制劑。美國Neopharm公司采用被動載藥技術開發(fā)米托蒽醌脂質體制劑,他們在磷脂的雙分子層中添加荷負電的心磷脂,由于心磷脂可以和米托蒽醌強烈相互作用,因此米托蒽醌可以包裹于磷脂雙分子層中。臨床前研究表明,得到的處方安全性有所提高,但是對于療效的改善不是很明顯。一期臨床研究則發(fā)現(xiàn),脂質體藥物和游離藥物相比,可以顯著增加偶發(fā)性感染的幾率。出于安全性的考慮,該產(chǎn)品被停止研發(fā)。加拿大INEX公司的脂質體研究小組則采用主動載藥技術(pH梯度法)開發(fā)米托蒽醌脂質體制劑,在他們的研究中,使用DSPC和膽固醇作為磷脂雙層,300mmol·L-1的檸檬酸梯度進行載藥,脂質體的粒度在100nm左右,結果發(fā)現(xiàn)制備得到的脂質體處方,其抗腫瘤效果不如游離的米托蒽醌。為了改善脂質體的治療效果,最終他們把磷脂雙層的組成改為DMPC和膽固醇,得到了治療指數(shù)改善的處方。但是由于DMPC的相轉變溫度在21℃左右,在儲存期內藥物的滲漏有可能增加,處方會不穩(wěn)定,因此該處方最終也被放棄。此外,蛋白受體靶向脂質體、葉酸靶向脂質體等高端米托蒽醌脂質體制劑也在研究中。本實驗采用銅離子梯度法制備了米托蒽醌脂質體(Mit-lipo),考察了其放置穩(wěn)定性,并與米托蒽醌游離藥(Mit-free)的藥動學、藥效學進行了對比研究。1實驗動物的分離和鑒定R-211旋轉蒸發(fā)儀(香港步琪公司);NanoS90綠光粒度測定儀(美國馬爾文公司);Waters2690液相系統(tǒng)(美國Waters公司);TGL-16G高速離心機(上海安亭科學儀器廠);鹽酸米托蒽醌(重慶凱林公司,批號M20070104);氫化大豆卵磷脂(HSPC,德國Lipoid公司,批號256205-1);膽固醇(西安力邦制藥有限公司,批號20060406);三氯甲烷,硫酸銅,氯化銅,組氨酸,異丙醇,蔗糖,三乙胺);庚烷磺酸鈉;甲醇,乙腈為色譜純;RPMI1640培基(Sigma公司);胎牛血清(Gibco公司);5%葡萄糖注射液(石家莊四藥有限公司);小鼠L1210細胞株(中科院上海生命科學研究院細胞資源中心);清潔級昆明小鼠(河北省實驗動物中心,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK[冀]2008-1-003);BDF1小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK[京]2006-0009)。2方法和結果2.1脂質體離子梯度的制備將質量比3∶1的HSPC和膽固醇溶于氯仿中,置于旋轉蒸發(fā)器中,減壓回收氯仿成膜。加入0.3mol·L-1銅鹽內相溶液,旋轉將膜洗下并水化一定時間。采用高壓擠出設備將空白脂質體整粒,之后通過透析以蔗糖/組氨酸溶液替換脂質體外的銅離子溶液,從而使脂膜內外形成離子梯度。將藥物水溶液與脂質體混懸液混合孵育,即得米托蒽醌脂質體。2.2正交實驗結果根據(jù)單因素考察和預實驗的結果選取藥脂比、不同銅鹽內相溶液(采用三乙胺調節(jié)pH值)、載藥溫度和載藥時間4個因素,每個因素選3個水平,按L9(34)正交實驗表進行正交實驗,以脂質體的包封率(EE%)為評價指標,實驗因素與水平見表1,正交實驗結果見表2。由極差R可知,影響因素的主次順序為:A>C>D>B,最佳條件為A2B2C2D3。按照優(yōu)選條件,藥脂比為1∶10,內相溶液為0.3mol·L-1pH7.5硫酸銅三乙胺溶液,孵育溫度60℃,孵育時間30min,按照載藥量1mg·mL-1,連續(xù)制備3批米托蒽醌脂質體。2.3脂質體外觀表現(xiàn)將米托蒽醌脂質體用水稀釋適當倍數(shù)后,采用冷凍蝕刻電鏡法觀察,可見脂質體外觀圓整,粒徑分布較均勻。用NanoS90綠光粒度測定儀測定樣品的平均粒徑為(99.5±1.9)nm,多分散系數(shù)PDI在0.02~0.05之間。脂質體粒徑分布見圖1,冷凍蝕刻電鏡照片見圖2。2.4脂質體中米托的檢測采用葡聚糖凝膠SephadexG75色譜柱,洗脫液為0.9%氯化鈉,室溫下進行。精密移取米托蒽醌脂質體100μL上柱,氯化鈉溶液洗脫,按照藍色色帶分段收集脂質體于10mL量瓶中,游離藥于5mL量瓶中,分別用異丙醇定容。采用HPLC分別測定脂質體部分和游離部分米托蒽醌的含量。脂質體溶液中米托蒽醌總量的測定:精密移取米托蒽醌脂質體100μL,用異丙醇定容至10mL量瓶中,進行HPLC檢測。液相色譜條件為:十八烷基鍵合硅膠色譜柱,以緩沖液(取庚烷磺酸鈉6.6g,加冰醋酸9.0mL,用水溶解并稀釋至1000mL)-乙腈(70∶30)為流動相;檢測波長:244nm,柱溫:30℃,流速:1mL·min-1。包封率(%)=脂質體所包封的米托蒽醌的量/(脂質體所包封的米托蒽醌的量+游離米托蒽醌的量)×100%。3批樣品包封率測定結果的平均值為(95.0±0.6)%。2.5降低溶血透照率的方法HSPC是構成脂質體的關鍵輔料,其在生產(chǎn)貯存過程中會發(fā)生水解和氧化,從而導致膜的流動性降低,引起脂質體的聚集和沉淀,加速藥物滲漏,產(chǎn)生毒性。已知HSPC為含有不同長度碳鏈的磷脂酰膽堿混合物,其中十六碳和十八碳的兩條側鏈比例為13∶86,因此產(chǎn)生的溶血卵磷脂以十八碳鏈卵磷脂為主。故本實驗以單硬脂酰卵磷脂為對照品,采用薄層色譜法對脂質體中的溶血卵磷脂進行限度檢測。精密稱取適量單硬脂酰卵磷脂對照品,用甲醇溶解并定容,得到質量濃度為0.2mg·mL-1的溶血卵磷脂對照溶液。精密量取米托蒽醌脂質體0.5mL,分別加入1.5mL甲醇和0.5mL氯仿混勻,作為供試品溶液。精密量取供試品溶液和對照溶液各10μL分別在GF254硅膠板上點樣,以甲醇-氯仿-氨水=50∶13∶1.4為展開劑進行展開,展開前沿到達大約7cm處時取出晾干,放入碘缸內熏蒸約10min后顯色,比較兩斑點的大小和深淺。3批米托蒽醌脂質體的溶血卵磷脂均小于1.0mg·mL-1,薄層照片見圖3。2.6包封率、溶血膽固醇的變化將3批米托蒽醌脂質體在2~8℃條件下放置,于第0、3、6個月分別取樣,考察粒徑分布、包封率、溶血卵磷脂的變化情況。結果顯示,脂質體外觀性狀良好,粒度、包封率、溶血卵磷脂沒有明顯變化,各項檢測結果見表3。2.7藥代動力學研究結果取接種7d的L1210腹水瘤BDF1小鼠,斷頸處死,無菌條件下以RPMI1640培養(yǎng)基稀釋腹水,調整瘤細胞數(shù)為2.5×106個·mL-1。將瘤細胞懸液腹腔接種于雄性BDF1小鼠,接種體積0.2mL。接種完成后,剩余瘤細胞懸液在光鏡下計數(shù),活瘤細胞數(shù)>95%。接種24h后,將動物按體重隨機分為3組,每組10只,分別經(jīng)尾靜脈單次注射給予Mit-lipo6mg·kg-1、Mit-free6mg·kg-1及5%葡萄糖注射液。每天監(jiān)測動物的體重和存活情況,60d后終止實驗。實驗結果以動物中位生存時間(MST)和生命延長率(ILS)來評價藥物的治療效果。ILS=[(給藥組MST/對照組MST)-1]×100%。以動物體重的降低來評價藥物的毒性。數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件Survival的Kaplan-Meier過程進行生存分析。結果顯示,與空白組相比,Mit-lipo和Mit-free均顯著延長了荷瘤鼠的生存時間(P<0.01),且Mitlipo較Mit-free的ILS略大。體重下降的比較中可見,Mit-free的動物體重下降較Mit-lipo大,這表明了游離藥物的毒性要大于脂質體藥物的毒性,見表4。2.8血藥濃度與準確度KM小鼠72只,隨機分為2組,每組36只,雌雄各半。第一組尾靜脈注射Mit-free4mg·kg-1,給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、4h取雌雄各3只小鼠進行眼眶靜脈取血。第二組尾靜脈注射Mit-lipo4mg·kg-1,給藥后0.083、0.5、1、4、8、24h取雌雄各3只進行眼眶靜脈取血。將鼠血置于肝素抗凝管中,以2500r·min-1離心10min,取上層血漿50μL,加入純化水50μL,加入酸化異丙醇50μL,甲醇350μL,漩渦混合30s,-20℃放置1h,10000r·min-1離心10min,取上清液20μL進行HPLC測定。液相色譜條件為:十八烷基鍵合硅膠色譜柱;C18保護柱;檢測波長:650nm;流動相:緩沖液(取庚烷磺酸鈉6.6g,加冰醋酸9.0mL,用水溶解并稀釋至1000mL)-乙腈(70∶30);柱溫:30℃;流速1.0mL·min-1。采用DAS(ver2.1.1)藥動學軟件對血藥濃度數(shù)據(jù)進行計算。血漿樣品中內源性物質不干擾待測物的測定;米托蒽醌的血漿濃度在0.01~50μg·mL-1內線性關系良好,相關系數(shù)0.999;米托蒽醌低、中、高3個質量濃度(0.1、1.0、10.0μg·mL-1)的回收率為92.0%、98.2%和99.1%;日內精密度均小于8.5%,日間精密度均小于10.3%。藥動學統(tǒng)計參數(shù)見表5,藥動學曲線見圖4。與Mit-free相比,Mitlipo具有更高的AUC和t1/2,更低的清除速率和更小的分布容積。3納米托脂質體的載藥特性米托蒽醌為水溶性藥物,提高水溶性藥物的包封率是脂質體制劑的一大難題。有報道顯示,應用金屬離子梯度法可以實現(xiàn)多柔比星的成功裝載,其原因在于多柔比星能與金屬離子形成復合物。由于米托蒽醌與多柔比星同屬于蒽環(huán)類抗腫瘤藥,并且可以和Cu2+形成穩(wěn)定的復合物,由此推斷米托蒽醌可以通過銅離子梯度法實現(xiàn)藥物的裝載。在本實驗中,系統(tǒng)的研究了不同pH值、不同陰離子的銅鹽為內相的米托蒽醌脂質體的制備,分析得出最優(yōu)處方的載藥機制如下。當弱堿性藥物米托蒽醌與空白脂質體孵育時,在外相pH值環(huán)境下呈電中性的米托蒽醌跨膜擴散進入脂質體內水相,其中一部分米托蒽醌迅速質子化然后與SO42-形成穩(wěn)定的沉淀;另一部分米托蒽醌則與Cu2+結合形成穩(wěn)定的復合物。以上兩種機制形成的膜內外藥物濃差促使膜外的米托蒽醌繼續(xù)跨膜擴散,進入膜內后被SO42-和Cu2+所捕獲,最終使得大部分米托蒽醌包封于脂質體中。另外2種內相脂質體包封率低的原因分析如下。由于Cl-與米托蒽醌不能形成沉淀,因此以氯化銅做內相時只存在銅離子絡合一個載藥動力,所以包封率較硫酸銅內相脂質體略差。采用三乙胺調節(jié)pH值的硫酸銅較不調節(jié)pH的硫酸銅做內相包封率更高的原因可能是三乙胺在內相脫氫后溢出脂質雙層膜,留在膜內的H+促進米托蒽醌質子化后與硫酸根沉淀,然后繼續(xù)拉動