利瑪原甲藻對(duì)腹瀉性貝毒的生物合成機(jī)制

利瑪原甲藻對(duì)腹瀉性貝毒的生物合成機(jī)制

1常使用的毒素海洋底生甲藻是指生活在海拔高度以上的重要甲藻生態(tài)群的意義。作為國(guó)際藻類入侵的重要領(lǐng)域，近年來(lái)，對(duì)海洋底藻的研究越來(lái)越受國(guó)際紅景觀的影響（黃令風(fēng)，李少軍，2000）。根據(jù)研究，海洋底藻不同于浮游生物，但關(guān)于其生理和生態(tài)特征的信息很少。軟馬原生甲是一種廣泛存在于中國(guó)海南省三亞海域的大型海域藻類，主要附著于大而惡劣的海生甲藻。它可能會(huì)產(chǎn)生副作用性粉質(zhì)沉積物（ps），因此，柳馬原甲藻成為研究底棲甲藻的熱點(diǎn)。腹瀉性貝類毒素是一類多醚類化合物,其成分主要有大田軟海綿酸(Okadaicacid,OA)、鰭藻毒素(Dinophysistoxins,DTX)、扇貝毒素(Pectenotoxin,PTX)和(Yessotoxin,YTX),其中OA和DTX是導(dǎo)致腹瀉性貝毒中毒的主要毒素類型.OA是蛋白磷酸酶PP1(ProteinPhosphatase)和PP2A(ser/threProteinPhosphatase2A)的特異性抑制劑,通過(guò)特異性地作用于蛋白磷酸酶PP1和PP2A抑制酶的去磷酸化,引起信號(hào)傳導(dǎo)途徑的變化,造成機(jī)體中毒(Svenssonetal.,2003).OA和DTX還是腫瘤促進(jìn)因子,可引致DNA加合物的形成,世界范圍內(nèi)日趨增加的胃腸道腫瘤可能與OA和DTX1的接觸有關(guān)(Garcíaetal.,2005).另外,由于OA獨(dú)特的致癌作用在研究癌癥機(jī)理及抗癌新藥等方面具有重要價(jià)值(楊維東等,2005).同時(shí),由于微藻培養(yǎng)容易控制,分離步驟相對(duì)簡(jiǎn)單,因此利用微藻制取生物毒素已成為海洋生物技術(shù)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題(秦路平,2001).日本海洋生物工程研究公司已成功實(shí)現(xiàn)利用水華束絲藻制取石房蛤毒素(Saxitoxin,STX)和海洋細(xì)菌生產(chǎn)河豚毒素.因此,研究和探討DSP毒素生物合成機(jī)制不僅是藻毒素毒理學(xué)研究的需要,同時(shí)對(duì)于DSP的深度研發(fā)也具有重要意義.許多藻類都能夠產(chǎn)生腹瀉性貝毒,如Dinophysisacuminata、D.acuta、D.caudata、D.fortii、D.mitra、D.norvegica、D.Sacculus、ProrocentrumlimaDodge、P.concavumFukuyo、P.hoffmannianumFaust、P.maculosumFaust和P.faustiaeMorton等,但由于Dinophysisspp.的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)非常困難(LawrenceandCembella,1999),因此利瑪原甲藻通常可作為DSP的毒藻模型,并已成為OA、DTX1毒素標(biāo)準(zhǔn)的可靠來(lái)源(Bravoetal.,2001).許多研究指出,毒素的合成并不是藻類新陳代謝所固有的,環(huán)境因子特別是營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)藻毒素的生成具有很大影響(張清春等,2005;彭喜春等,2006).然而,目前有關(guān)環(huán)境因子對(duì)利瑪原甲藻產(chǎn)毒影響的研究極少(McLachlanetal.,1994),國(guó)內(nèi)則未見有關(guān)底棲甲藻產(chǎn)毒的報(bào)道.本文研究了利瑪原甲藻不同生長(zhǎng)期、不同營(yíng)養(yǎng)鹽條件下的生長(zhǎng)狀況和OA的生成情況,以期為進(jìn)一步明確利瑪原甲藻產(chǎn)毒機(jī)制和DSP毒素的生理學(xué)作用奠定基礎(chǔ),并為進(jìn)一步利用利瑪原甲藻制取DSP毒素提供參考和依據(jù).2材料和方法表面活性劑2.1ccmp簡(jiǎn)介利瑪原甲藻(Prorocentrumlima),由美國(guó)CCMP(Provasoli-GuillardNationalCenterforCultureofMarinePhytoplankton)提供,編號(hào)2579.2.2儀器、試藥與儀器DiarrheticShellfishPoisonQuickTestKit(PanapharmLaboratoriesCo.,Ltd.Japan),海鹽(Aquasonic,Ingieburn,N.S.W.,Australia),維生素VB1、維生素VB12、生物素(上海伯奧生物科技有限公司),其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.CKX41型倒置生物顯微鏡(Olympus),CD2105型Xutemp智能生物人工氣候箱(Xutemp,杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司),353型酶標(biāo)儀(LabsystemsMultiskanMK)2.3生物細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)液為3.3%人工海水按照f(shuō)/2培養(yǎng)液改良配方加營(yíng)養(yǎng)鹽配成,經(jīng)0.22μm纖維濾膜除菌所得.將保存藻種接種到三角瓶中,置于溫度(22±1)℃,光照強(qiáng)度4000lx、光暗循環(huán)為L(zhǎng):D=12h:12h的人工氣候箱中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng).取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期利瑪原甲藻,用大型藻記數(shù)板計(jì)算其細(xì)胞密度后接種,接種密度約為9.8×103個(gè)·L-1,接種后置于人工氣候箱中培養(yǎng).隔天于固定時(shí)間取樣在倒置顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù),繪制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線.實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行.2.4營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)藻細(xì)胞毒素含量的影響將利瑪原甲藻在低水平N(N:P比為1.5:1)、P(N:P比為150:1)2種營(yíng)養(yǎng)鹽條件下進(jìn)行培養(yǎng),f/2培養(yǎng)液組為對(duì)照組,起始藻密度均為1.6×106個(gè)·L-1.N、P的濃度如表1所示,其他營(yíng)養(yǎng)鹽的濃度與f/2相同.取平臺(tái)期藻細(xì)胞進(jìn)行毒素含量的測(cè)定.2.5dsp毒素的檢測(cè)分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期前期(7d)、中期(19d)、后期和平臺(tái)期(41、59和71d)的藻培養(yǎng)物10mL,3500rpm離心5min收集藻細(xì)胞.棄上清,藻細(xì)胞沉淀煮沸5min.加入500μL90%的甲醇和少量二氧化硅,在旋渦混合器上振蕩,利用二氧化硅使細(xì)胞破壁,毒素釋放溶解于甲醇中,7500rpm離心5min,取上清液,加入500μL雙蒸水,混合均勻.DSP毒素的測(cè)定采用腹瀉性貝毒快速檢測(cè)試劑盒,該試劑盒采用抗OA的單克隆抗體,通過(guò)酶聯(lián)免疫分析方法(ELISA),對(duì)OA進(jìn)行專一性的檢測(cè).測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行.2.6統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用t-檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異檢驗(yàn).3結(jié)果和分析結(jié)果和分析3.1藻細(xì)胞衰亡期測(cè)定圖1為初始藻密度為9.8×105個(gè)·L-1的利瑪原甲藻生長(zhǎng)曲線.從圖中可以看出,藻細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的延滯期,很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,45d后進(jìn)入平臺(tái)期,71d內(nèi)未見藻細(xì)胞進(jìn)入衰亡期.3.2藻細(xì)胞中ua的含量不同生長(zhǎng)期利瑪原甲藻中OA的含量如圖2所示.由圖2可以看出,隨培養(yǎng)時(shí)間的推移,利瑪原甲藻中OA的總體水平逐漸增加,并在平臺(tái)期達(dá)到最大.單個(gè)藻細(xì)胞中OA的含量在對(duì)數(shù)前期較高,對(duì)數(shù)中期略有下降,對(duì)數(shù)末期有所增加,與對(duì)數(shù)中期相比,平臺(tái)期(第59d和71d)單個(gè)藻細(xì)胞中OA的含量明顯增加(p<0.05).3.3營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)利瑪原甲藻細(xì)胞密度的影響在相同的起始密度下(1.6×106個(gè)·L-1),不同營(yíng)養(yǎng)鹽條件下利瑪原甲藻的生長(zhǎng)狀況明顯不同(圖3).低營(yíng)養(yǎng)鹽下,利瑪原甲藻生長(zhǎng)明顯比對(duì)照組差,藻細(xì)胞密度顯著低于對(duì)照組,平臺(tái)期藻細(xì)胞密度順序?yàn)閷?duì)照>N限制>P限制.3.4ua總含量不同營(yíng)養(yǎng)鹽條件下平臺(tái)期利瑪原甲藻中OA的含量如表2所示.從表2中可以看出,OA總含量從高到低依次為對(duì)照組>低N>低P;單個(gè)藻細(xì)胞中OA含量從高到低依次為低P>低N>對(duì)照組,且低N、低P兩組與對(duì)照組相比有顯著性差異(p<0.05).4利瑪原甲藻中的毒素利瑪原甲藻分布非常廣泛.研究發(fā)現(xiàn),利瑪原甲藻的產(chǎn)毒有很大的個(gè)體差異,來(lái)自不同區(qū)域,甚至同一地區(qū)的不同藻株,其毒素組成和水平都不盡相同,這種差異可能緣自遺傳差異,也可能源于藻生理狀態(tài)上的差異.Boua觙cha等(2001)采用蛋白磷酸酶抑制法檢測(cè)了利瑪原甲藻不同地理株的毒素含量,發(fā)現(xiàn)OA含量在6261.3~128.3ng·mg-1(粗提物)之間;Nascimento等(2005)采用高效液相色譜(HPLC)對(duì)來(lái)自歐洲、北美、日本、澳大利亞、新西蘭、塔希提島和蘇格蘭等地區(qū)的利瑪原甲藻毒素含量進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)所有藻株均可產(chǎn)生OA,含量在0.4~17.1pg·cell-1,同一藻株中毒素的水平因生長(zhǎng)期不同而有一定差異,OA含量介于2.0~12.2pg·cell-1.本研究采用快速簡(jiǎn)便的酶聯(lián)免疫分析方法,對(duì)利瑪原甲藻CCMP2579株毒素生成情況進(jìn)行了研究.結(jié)果顯示,OA含量介于91.29~110.46pg·cell-1,與Nascimento等(2005)的結(jié)果存在數(shù)量級(jí)上的差異,這可能是因測(cè)定方法或株系間差異所致.不同測(cè)定方法可導(dǎo)致OA檢測(cè)結(jié)果差異,如Morton和Tindall(1996)利用液相色譜法和兩種單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(UBE和Rougie試劑盒)測(cè)定P.hoffmannianum和利瑪原甲藻中DSP的含量時(shí)發(fā)現(xiàn),3種方法對(duì)只產(chǎn)OA的P.hoffmannianum測(cè)定結(jié)果一致;但對(duì)利瑪原甲藻DSP而言,液相色譜可以檢測(cè)到OA和DTX-1的存在,檢測(cè)到的毒素含量比較高;UBE試劑盒由于與DTX-1幾乎沒有交叉反應(yīng),檢測(cè)到的毒素含量最少,比能與DTX-1發(fā)生交叉反應(yīng)的Rougie試劑盒的檢測(cè)值小近1倍.另外,不同株系間毒素的水平往往存在較大差異,如Touzet等(2007)研究表明,分離自愛爾蘭考克港的微小亞歷山大藻(Alexandriumminutum)株系的毒性比其他國(guó)家海域分離得到的株系毒性低.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),利瑪原甲藻中OA的總含量隨生長(zhǎng)周期的行進(jìn)而逐漸提高,在平臺(tái)期達(dá)到最高水平.單個(gè)藻細(xì)胞中OA含量在平臺(tái)期也達(dá)到最大,但其含量的變化并非呈遞增規(guī)律,而是在對(duì)數(shù)期出現(xiàn)一定的波動(dòng).對(duì)數(shù)中期OA含量較對(duì)數(shù)前期和對(duì)數(shù)后期低,對(duì)數(shù)中后期開始OA含量才出現(xiàn)遞增趨勢(shì),這與Nascimento等(2005)的研究結(jié)果類似.他們的研究發(fā)現(xiàn),利瑪原甲藻在前25d處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,在此期間,單個(gè)細(xì)胞OA含量在第1d最高,隨后1周內(nèi)逐漸下降,從第8d開始維持穩(wěn)定,但對(duì)數(shù)末期OA含量開始逐漸增加,進(jìn)入平臺(tái)期時(shí)達(dá)到最大值.這一結(jié)果提示,藻細(xì)胞中毒素的含量可能與藻的生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān).在環(huán)境適宜的條件下,藻細(xì)胞迅速分裂進(jìn)入對(duì)數(shù)期,這一過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)容物會(huì)增加,OA的生物合成也在進(jìn)行,但由于細(xì)胞的一分為二,內(nèi)容物在兩個(gè)細(xì)胞之間進(jìn)行分配,使單個(gè)細(xì)胞中OA的含量維持在一定水平.進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期后,由于細(xì)胞分裂速率降低,使OA可以在細(xì)胞中累積.細(xì)胞分裂速率越低,單位細(xì)胞中累積的OA就越多.平臺(tái)期時(shí),多數(shù)細(xì)胞停止分裂,OA含量達(dá)到最高(Faust,1991).為進(jìn)一步探明利瑪原甲藻的毒素合成與環(huán)境因素的關(guān)系,本研究探討了不同營(yíng)養(yǎng)鹽條件下毒素的生成情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn),低水平的N、P抑制了利瑪原甲藻的生長(zhǎng),這一現(xiàn)象與國(guó)內(nèi)外許多研究結(jié)果相似.Wang和Hsieh(2002)研究發(fā)現(xiàn),低N、低P均能抑制塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)CI01的生長(zhǎng);Touzet等(2007)的研究也表明,微小亞歷山大藻在低N、低P條件下細(xì)胞生長(zhǎng)密度較對(duì)照組明顯偏低;石巖峻等(2003)研究表明,N限制可顯著促進(jìn)塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞的分裂,低N條件下的塔瑪亞歷山大藻最先進(jìn)入對(duì)數(shù)期,然后依次是中N和高N條件.由于在藻細(xì)胞的生長(zhǎng)后期,N缺乏對(duì)生物量的積累是不利的,因而低N下生物量明顯偏低;低P對(duì)塔瑪亞歷山大藻的生長(zhǎng)也是不利的,不但細(xì)胞分裂緩慢,而且生物量低.毒素的合成并不是藻類新陳代謝所固有的,一般認(rèn)為是壓制或清除其它藻類競(jìng)爭(zhēng)者,在生存中獲得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的一種策略(彭喜春等,2006).許多研究表明,環(huán)境脅迫條件下,次生代謝物的合成是增加的,Johansson和Granéli(1999)研究表明,N、P限制條件下小定鞭藻(Prymnesiumparvum)的溶血活性明顯增加;Boyer等(1987)研究發(fā)現(xiàn),低P條件下塔瑪原膝溝藻(Protoaunyanlaxtamarensis)在平臺(tái)期毒素含量比對(duì)照組高3到4倍.與此觀點(diǎn)一致,本實(shí)驗(yàn)對(duì)利瑪原甲藻在N、P限制條件下的生長(zhǎng)及產(chǎn)毒情況進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照相比,低N、P條件下(采用f/2培養(yǎng)基),利瑪原甲藻的細(xì)胞生長(zhǎng)密度受到明顯抑制,平臺(tái)期藻細(xì)胞生長(zhǎng)密度和OA總含量為對(duì)照組>N限制組>P限制組,但單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)毒水平卻與之相反,從高到低依次為P限制組>N限制組>對(duì)照組,這可能是由于環(huán)境條件的限制,促使利瑪原甲藻產(chǎn)毒以減小不利生態(tài)條件帶來(lái)的損害,因此DSP的合成與