抗腫瘤藥物篩選課件

抗腫瘤藥物篩選侯桂琴鄭州大學藥學院一細胞篩選篩選方法1.四氮唑藍（MTT）還原法原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值應用：用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。特點：靈敏度高、經(jīng)濟。

缺點：產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。步驟：（1）制備單細胞懸液；(2)對細胞進行計數(shù)，計數(shù)后接種于96孔板，一般每孔細胞數(shù)為5000個（可先做細胞倍增試驗確定每孔中最佳細胞數(shù)）；（3）將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)；（4）24h后更換培養(yǎng)基，并在每孔細胞中加入不同濃度藥物，繼續(xù)培養(yǎng)；（5）24或48h以后，加入MTT溶液，再培養(yǎng)3-6h,停止培養(yǎng)，棄取培養(yǎng)基,加入DMSO，每孔150ul，輕微震蕩混勻；（6）把96孔板放入酶標儀中，490nm測定吸光度。CCK-8法2.集落形成法：測定單個細胞的增殖能力原理：單個細胞在體外持續(xù)分裂增殖6次以上，其后代所組成的細胞群體，稱克隆或集落。一般50個以上細胞，通過計數(shù)克隆形成率，定量分析單個細胞的增殖能力。用途：抗癌藥物敏感性試驗，腫瘤放射生物學試驗常用方法：平板克隆形成試驗，軟瓊脂克隆形成試驗注意：適合貼壁細胞，細胞要分散均勻，操作要柔和。3.臺盼藍排斥試驗原理：臺盼藍能使死細胞著色（淡藍色），而活細胞拒染。

活細胞總數(shù)×100活細胞率（％

）＝活細胞總數(shù)＋死細胞總數(shù)注意：簡單，最常用。染色時間不宜過長。特點：懸浮細胞較方便，貼壁細胞要進行消化，此步誤差大。二微生物學篩選方法(抗腫瘤抗生素)1.噬菌體法噬菌體：是一類能感染微生物的病毒（1）抗噬菌體法：干擾DNA代謝的抗生素如放線菌素、博來霉素常能抑制噬菌體在細菌細胞內的生長，從而不產生噬菌體顆粒而出現(xiàn)抗噬菌體的現(xiàn)象。（2）溶原性菌誘導法：除烈性噬菌體外，還有一種噬菌體，其基因組直接螯合到細菌染色體DNA，不復制，因其大部分基因功能受到了“阻遏物”阻抑，這種帶前噬菌體的菌株稱溫和性或溶原性菌。但是當“阻遏物”的量由于細胞內或環(huán)境因子（物理、化學）而降低時，溶原性就不能維持，前噬菌體開始生長，是細菌裂解，稱為誘導作用。一些抗腫瘤抗生素有誘導能力。2.細菌變種法(1)人工培育變種如:使細菌模仿腫瘤細胞的某些代謝特點使細菌對核酸或蛋白合成抑制劑敏感(2)檢測突變作用如:依賴鏈霉素的菌株3.抗代謝法

抗代謝物在無機氮源的合成培養(yǎng)基中顯示抗菌作用，而在普通有機氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基中無抗菌作用（因為有機氮源可將具有抗菌作用的物質代謝），利用此特點，選擇無機氮源試驗有抗菌作用的物質，作為抗代謝的初篩方法。三精原細胞法(抗生素和植物藥)1.建立依據(jù)B型精原細胞具有高度敏感性2.實驗方法及判定22－28g雄性小鼠，藥物直接注入睪丸，不同濃度，每一濃度用2－3只，注射3天，處死動物，睪丸固定，石蠟包埋切片，蘇木精－伊紅染色，顯微鏡觀察。四利用分子靶點篩選1.抑制血管生成的篩選模型體外：血管內皮細胞培養(yǎng)體內：動物眼角膜囊地鼠頰囊裸鼠外耳皮下雞胚絨毛尿囊膜雞胚絨毛尿囊膜模型雞胚的生物學構造尿囊卵黃囊對照組低濃度藥物實驗組中濃度藥物實驗組高濃度藥物實驗組操作步驟：（1）于實驗前72h孵育受精蛋（2）實驗進行前以照蛋箱透照孵育的種蛋，凡已正常發(fā)育的種蛋可照見胚胎的影子，用鉛筆做記號，棄取未發(fā)育種蛋（3）用碘酒、酒精消毒蛋殼。敲碎蛋殼把雞胚移入平皿中，加入EagleFs培養(yǎng)液5-10ml，然后，可選擇在雞胚尿囊膜血管網(wǎng)的任何位置放置小塊明膠海綿作為篩選抗血管生成藥物的載體，然后加入不同濃度的血管生成抑制劑。（4）于加藥后24h、48h和72h分別在顯微鏡下觀察藥物作用結果，并照相。（5）血管計數(shù)?？山Y合自動圖像分析系統(tǒng)、攝像等技術完成血管生成抑制率＝（對照組血管面積－藥物組血管面積）/對照組血管面積×100％2.以端粒酶為靶點的藥物篩選端粒：真核細胞染色體末端的特殊結構。功能是維持染色體穩(wěn)定性。，防止染色體DNA降解，保護染色體結構基因，調節(jié)正常細胞生長?！吧臅r鐘”“有絲分裂的計數(shù)器”端粒酶功能：通過其逆轉錄酶活性復制和延長端粒DNA來穩(wěn)定染色體DNA端粒的長度。端粒酶活性測定方法端粒酶抑制劑3.細胞凋亡通路靶點

細胞周期調控靶點與侵襲相關的靶點耐藥相關的分子靶點靶點選擇原則：特異性、有效性、綜合性、個性化五動物模型整體動物實驗法是評價一個藥物是否有效的最主要方法整體動物在腫瘤藥理學研究中的作用：1.研究新開發(fā)藥物對腫瘤的防治作用；2.對抗腫瘤藥物進行篩選，探索抗腫瘤機理；3.探索藥物和目前常規(guī)腫瘤治療方法的綜合應用以提高療效。

常用宿主動物：裸小鼠（“活的試管”）特點：先天無毛，無胸腺，T淋巴細胞功能完全缺失，對異種移植不產生排斥反應。缺點：費用高，飼養(yǎng)條件高，不宜大量繁殖。一般不用于初篩。應用：觀察藥物對癌細胞逆轉作用，抑制增殖及誘導凋亡作用。C57BL/6小鼠特點：黑毛，體型小，性情溫順，易飼養(yǎng)，藥敏性好，為研究Lewis肺癌首選。應用：藥物體內初篩。模型建立方法實體瘤建立及評價：1.小塊瘤體接種法2.腫瘤細胞懸液接種法3.培養(yǎng)細胞移植法療效評價：腫瘤抑制率＝（對照組瘤重－給藥組瘤重）/對照組瘤重×100％腹水瘤建立及評價：評價：對照組通常2-3周內死亡，治療組一般觀察50d左右，計算生命延長率。生命延長率＝（治療組平均存活天數(shù)－對照組平均存活天數(shù)）/對照組平均存活天數(shù)×100aysTumorValume(mm3)ACabcdBab六基因芯片技術1.原理是一種建立在雜交測序基本理論上的全新技術，它利用固定在芯片上的幾萬至幾十萬條探針與樣品進行雜交，在一步實驗中獲取大量的信息。2.基本技術路線①基因的選擇與實驗設計

根據(jù)表達譜數(shù)據(jù)庫選擇5000-10000個與發(fā)育及疾病相關的基因，制備藥物篩選芯片。②芯片的制備③細胞的培養(yǎng)與藥物刺激

根據(jù)目的藥物及表達譜芯片數(shù)據(jù)庫中細胞表達譜選擇適當?shù)募毎?，用適當計量的藥物加入細胞培養(yǎng)液中，不同的時間取樣，抽提刺激前后的mRNA。④大白鼠飼養(yǎng)與藥物刺激

用常規(guī)方法飼養(yǎng)大白鼠，用適當計量的藥物喂養(yǎng)大白鼠，不同的時間取大白鼠的適當器官（根據(jù)所篩選的藥物而定），