遺傳病的分子診斷課件

概述遺傳性疾病

是由遺傳物質(zhì)改變所導(dǎo)致的疾病或缺陷，按一定的方式垂直傳遞。我國(guó)每年新出生人口中6％患有不同的遺傳病，新增遺傳病患兒約120萬遺傳病的發(fā)病率逐漸升高2021/3/13遺傳病的分類基因病

染色體病體細(xì)胞遺傳病單基因遺傳病

多基因遺傳病2021/3/13一、單基因遺傳病的分子診斷2021/3/13定義單基因遺傳病(monogenicdisease)指單個(gè)基因突變所引起的遺傳病。

特點(diǎn)：病種較多，單個(gè)疾病發(fā)病率低臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣遺傳規(guī)律符合孟德爾定律2021/3/131.單基因遺傳病發(fā)病的分子機(jī)制單基因遺傳病的基因突變類型①基因的外顯子或內(nèi)含子完全或部分缺失②基因的單堿基突變③三核苷酸重復(fù)突變④基因部分片段重復(fù)轉(zhuǎn)錄，基因產(chǎn)物大小改變⑤插入突變，基因組其他部位的DNA片段插入到目的DNA序列內(nèi)2021/3/132.單基因遺傳病的分類常染色體顯性遺傳常染色體隱性遺傳X連鎖顯性遺傳X連鎖隱性遺傳

Y連鎖遺傳2021/3/13(1)常染色體顯性遺傳

(autosomaldominantinheritance,AD)致病基因位于常染色體一對(duì)等位基因中只要有一個(gè)致病基因就可表現(xiàn)出基本性狀男女患病機(jī)會(huì)相等如：先天性軟骨發(fā)育不全病、亨廷頓病2021/3/13(2)常染色體隱性遺傳

(autosomal

recessiveinheritance,AR)致病基因位于常染色體攜帶一個(gè)隱性致病基因的雜合子不表現(xiàn)癥狀，只有獲得一對(duì)隱性基因的純合子才表現(xiàn)出相應(yīng)癥狀男女受累機(jī)會(huì)均等如：苯丙酮尿癥、白化病2021/3/13(3)X連鎖顯性遺傳

(X-linkeddominantinheritance,XD)致病基因位于X染色體以顯性遺傳的方式向后代遺傳男性患者的女兒全部為患者，兒子全部正常，女性患者的子女中各有50％可能性是患者如：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥、假性甲狀腺功能減退病2021/3/13(4)X連鎖隱性遺傳

(X-linkedrecessiveinheritance,XR)致病基因位于X染色體女性在純合子時(shí)表現(xiàn)出相應(yīng)性狀；攜帶一個(gè)隱性致病基因時(shí)，為表型正常的致病基因攜帶者男性X染色體上有一個(gè)隱性致病基因就會(huì)發(fā)病如：甲型血友病、紅綠色盲2021/3/13(5)Y連鎖遺傳

(Y-linkedinheritance,YL)致病基因位于Y染色體伴隨Y染色體以顯性遺傳方式向男性后代傳遞只有男性才表現(xiàn)出相應(yīng)性狀如：外耳道多毛癥2021/3/132021/3/133.單基因遺傳病的基因診斷表型診斷

根據(jù)癥狀體征來判斷病因并診斷分子診斷（基因診斷）

直接檢測(cè)患者基因(DNA)或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)診斷疾病

基因診斷是當(dāng)前診斷遺傳病最精確的方法2021/3/13(1)基因診斷的思路從蛋白質(zhì)入手從蛋白質(zhì)到核酸，由表型至基因型從DNA入手由DNA到蛋白質(zhì)從候選基因入手2021/3/13從蛋白質(zhì)入手明確蛋白產(chǎn)物測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸序列合成DNA探針篩選編碼基因或cDNA克隆DNA測(cè)序確定導(dǎo)致疾病的分子缺陷2021/3/13從蛋白質(zhì)入手通過該策略診斷許多單基因遺傳疾病白化病苯丙酮尿癥鐮狀細(xì)胞貧血該策略已較少采用2021/3/13從DNA入手連鎖分析確定致病基因的染色體定位在該區(qū)域內(nèi)搜索、分離致病基因找到導(dǎo)致遺傳病的分子缺陷闡明正常與異?；虍a(chǎn)物的生理功能和病理效應(yīng)2021/3/13從DNA入手當(dāng)前遺傳性疾病診斷的主要策略杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良亨廷頓舞蹈病該策略的關(guān)鍵是DNA標(biāo)志物2021/3/13從候選基因入手將某一疾病基因初步定位以該區(qū)域中已克隆的無名基因、cDNA等為候選者根據(jù)定位結(jié)構(gòu)是否相同來鑒定疾病相關(guān)基因此方法具有速度快、效率高的優(yōu)點(diǎn)2021/3/13(2)基因診斷的途徑確定單基因遺傳疾病后，再確定基因檢測(cè)的方法采集先證者與其父母的DNA；攜帶者基因分析時(shí)，需采集與患者、攜帶者有血緣關(guān)系的親屬樣品從人體組織的有核細(xì)胞中提取分離DNA外周血有核細(xì)胞、口腔黏膜、毛囊細(xì)胞2021/3/13(2)基因診斷的途徑DNA印跡法(Southernblotting)

分析基因或基因片段的缺失、插入或動(dòng)態(tài)突變PCR與其衍生技術(shù)

分析核苷酸取代、缺失或插入造成的點(diǎn)突變基因芯片技術(shù)

自動(dòng)化、微量化、高通量2021/3/134.單基因遺傳病基因診斷中存在的問題(1)遺傳異質(zhì)性(geneticheterogeneity)由同一或不同基因座的不同突變所致的非常類似的表型同一種表型可由多個(gè)不同的基因型控制

大多數(shù)遺傳病都有遺傳異質(zhì)性2021/3/13遺傳異質(zhì)性1)等位基因異質(zhì)性

由同一基因座不同突變所致非常類似的表型β地中海貧血可由100多種突變引起2)基因座異質(zhì)性

由不同基因座不同突變所致非常類似的表型2021/3/134.單基因遺傳病基因診斷中存在的問題(2)基因突變的多樣性基因突變包括缺失、插入、替換和動(dòng)態(tài)突變等(3)臨床診斷是基因診斷的基礎(chǔ)基因診斷前注意臨床診斷的準(zhǔn)確性多數(shù)遺傳病需依靠多態(tài)性標(biāo)志物進(jìn)行家系連鎖分析，確定疾病相關(guān)基因2021/3/134.單基因遺傳病基因診斷中存在的問題(4)基因診斷方法的選擇根據(jù)基因診斷的目的慎重選擇方法產(chǎn)前診斷時(shí)，應(yīng)選擇高特異性和高靈敏度的方法，可同時(shí)應(yīng)用兩種以上原理不同的方法進(jìn)行檢測(cè)，減低誤診率2021/3/13(二)常染色體顯性遺傳病的分子診斷亨廷頓病

(Huntingtondisease,HD)常染色體顯性遺傳病常于30～45歲緩慢起病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的舞蹈樣不自主運(yùn)動(dòng)和智能障患者大多有家族史，患病率為5/10萬～10/10萬2021/3/131.HD基因的結(jié)構(gòu)與定位亨廷頓病相關(guān)基因ITl5

(interestingtranscript15)位于染色體4p16.3，由67個(gè)外顯子構(gòu)成，編碼產(chǎn)生蛋白質(zhì)huntingtinIT15基因外顯子1的起始密碼子ATG下游17個(gè)密碼子處有一段多態(tài)性的CAG重復(fù)序列，轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生一段聚谷氨酰胺連于huntingtin蛋白的N端2021/3/132.ITl5基因在HD中的變化正常IT15基因的(CAG)n重復(fù)長(zhǎng)度為9～34個(gè)重復(fù)單位HD患者n>36，最多超過120疾病狀態(tài)下，IT15基因(CAG)n重復(fù)的多少與發(fā)病的早晚、疾病的嚴(yán)重程度呈正比2021/3/132021/3/133.亨廷頓病的基因診斷方法基因診斷主要檢測(cè)(CAG)n重復(fù)次數(shù)普通PCR：檢測(cè)出重復(fù)次數(shù)較少的小片段Southern印跡法：分析重復(fù)次數(shù)很大的樣本2021/3/132021/3/13(三)常染色體顯性遺傳病的分子診斷鐮狀細(xì)胞貧血

(sicklecellanemia,SCA)2021/3/13(三)常染色體顯性遺傳病的分子診斷鐮狀細(xì)胞貧血

(sicklecellanemia,SCA)常染色體隱性遺傳病血紅蛋白基因突變導(dǎo)致鐮狀血紅蛋白(HbS)取代正常血紅蛋白(HbA)熱帶非洲黑人發(fā)病率高達(dá)40％2021/3/13

1.鐮狀細(xì)胞貧血的遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制珠蛋白基因第6位密碼子GAG變?yōu)镚TA，HbA的β鏈第6位谷氨酸被纈氨酸取代，形成HbS缺氧時(shí)，HbS溶解度降低，在細(xì)胞內(nèi)聚合，紅細(xì)胞變形扭曲成鐮刀狀2021/3/132鐮狀細(xì)胞貧血的基因分型純合子(βSβS)型

沒有正常的血紅蛋白，病情嚴(yán)重雜合子(βAβS)型鐮狀細(xì)胞基因攜帶者，一般無異常表現(xiàn)，僅在低氧情況下出現(xiàn)鐮狀紅細(xì)胞雙重雜合子型

臨床癥狀輕微2021/3/133.鐮狀細(xì)胞貧血的基因診斷方法限制性內(nèi)切酶分析法限制性內(nèi)切酶MstⅡDNA印跡法等位基因-RFLP連鎖分析2021/3/13限制性內(nèi)切酶分析法利用內(nèi)切酶MstⅡ消化待檢的DNA樣品正常的βA和突變的βS第5-7位密碼子序列：

正常βA：CCTGAGGAG

突變?chǔ)耂：CCTGTGGAG第6位密碼A變成T，使MstII不能識(shí)別2021/3/13(四)X連鎖顯性遺傳病的分子診斷脆性X綜合征

(fragileXsyndrome,FraX)X連鎖顯性遺傳病最常見的遺傳性智力障礙男性群體中的發(fā)生率為1/2000～1/1000，男、女患病的比率為2:12021/3/13脆性X綜合征2021/3/131.脆性X智力障礙基因的結(jié)構(gòu)與定位脆性X基因(FMR-1)缺陷使FMR-1蛋白(FMRP)生成減少或缺乏，導(dǎo)致脆性X綜合征FMR-1基因位于Xq27.3，在基因組中跨越38kb，由17個(gè)外顯子和16個(gè)內(nèi)含子組成2021/3/132.脆性X智力障礙基因的突變特征FMR-l基因5’端外顯子上的非翻譯區(qū)有一(CGG)n重復(fù)序列的多態(tài)性結(jié)構(gòu)，正常人群(CGG)n重復(fù)次數(shù)在6～50之間1)FMR-1基因(CGG)n重復(fù)序列異常擴(kuò)增前突變：(CGG)n重復(fù)數(shù)為50～200全突變：(CGG)n重復(fù)數(shù)>2002021/3/132.脆性X智力障礙基因的突變特征(2)FMR-1基因5’端CpG島的異常甲基化

FMR-1轉(zhuǎn)錄受抑制或減弱，F(xiàn)MRP表達(dá)受阻(3)FMR-1基因的缺失和點(diǎn)突變

FMR-1基因的錯(cuò)義突變和缺失型突變影響FMRP的正常結(jié)構(gòu)2021/3/133.脆性X綜合征的基因診斷方法1)Southernblot分析檢測(cè)(CGG)n的拷貝數(shù)和甲基化狀態(tài)確認(rèn)全突變與前突變適用于患者與攜帶者的診斷2)PCR方法擴(kuò)增(CGG)n重復(fù)序列，檢測(cè)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度嵌合體患者有較小的(CGG)n片段，也有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，可導(dǎo)致假陽性2021/3/13(五)X連鎖隱性遺傳病的分子診斷Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)和Becker肌營(yíng)養(yǎng)不良(BMD)X連鎖隱性遺傳性疾病，主要累與男性個(gè)體Xp上抗?fàn)I養(yǎng)不良蛋白(dystrophin)基因突變引起的一組肌肉疾病

2021/3/131.Dystrophin基因

Dystrophin基因定位于Xp21，長(zhǎng)達(dá)2400kb，有79個(gè)外顯子

DMD：dystrophin基因表現(xiàn)為顯著丟失甚至缺失，臨床癥狀較重

BMD：dystrophin基因結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但能夠指導(dǎo)合成蛋白，癥狀較輕2021/3/132.Dystrophin基因的突變特征基因突變率較高基因突變形式多樣缺失、點(diǎn)突變、重復(fù)、微小缺失或微小重復(fù)缺失和重復(fù)的熱點(diǎn)1)Dystrophin基因5’端和中央?yún)^(qū)2)小突變位于dystrophin基因的非編碼區(qū)2021/3/133.DMD/BMD的基因診斷方法(1)基因缺失的檢測(cè)常用方法Southern印跡法多重PCR定量PCR限制性內(nèi)切酶分析脈沖場(chǎng)凝膠電泳熒光原位雜交技術(shù)(FISH)多重連接依賴式探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)微陣列比較基因組雜交技術(shù)(array-CGH)2021/3/133.DMD/BMD的基因診斷方法(2)基因點(diǎn)突變的檢測(cè)變性高效液相色譜分析(DHPLC)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)異源雙鏈多態(tài)分析(HA)化學(xué)錯(cuò)配堿基裂解法(CMC)RT-套式PCR截短蛋白試驗(yàn)和直接測(cè)序2021/3/133.DMD/BMD的基因診斷方法(3)基因檢測(cè)應(yīng)注意的問題檢測(cè)技術(shù)尚難在一般實(shí)驗(yàn)室普與檢測(cè)中應(yīng)注意設(shè)置對(duì)照，做好質(zhì)量控制檢測(cè)前與患者溝通2021/3/13二、多基因遺傳病的分子診斷2021/3/131.多基因遺傳病的概念

多基因遺傳(polygenicinheritance)指生物和人類的許多表型性狀由不同座位的較多基因協(xié)同決定，而非單一基因的作用。2021/3/132.多基因遺傳特點(diǎn)基因微效性

多基因遺傳時(shí)，每對(duì)基因的性狀效應(yīng)是微小的協(xié)同作用

不同微效基因可協(xié)同累加作用，導(dǎo)致表型產(chǎn)生環(huán)境因素多基因遺傳表型受環(huán)境因素的影響，是基因與環(huán)境結(jié)合形成的一種性狀2021/3/132.多基因遺傳病的分子診斷策略(1)基因直接檢測(cè)法

適用于已知基因異常的疾病(2)基因間接檢測(cè)法

適用于致病基因已知，但其異常未知；或致病基因本身未知

對(duì)受檢者與其家系進(jìn)行連鎖分析，推測(cè)受檢者是否獲得致病基因2021/3/132.多基因遺傳病的分子診斷糖尿病的分子診斷冠心病的分子診斷阿爾茨海默病的分子診斷2021/3/13三、出生缺陷與產(chǎn)前診斷2021/3/13（一）出生缺陷指胚胎或胎兒在發(fā)育過程中發(fā)生的結(jié)構(gòu)或功能的異常。1.出生缺陷的類型畸形缺陷裂解缺陷發(fā)育不良變形缺陷2021/3/13（一）出生缺陷2.出生缺陷的發(fā)生因素源于受孕前的原因染色體異常、單基因缺陷、多基因缺陷源于受孕后的原因?qū)m內(nèi)暴露環(huán)境因素不明原因2021/3/13（二）產(chǎn)前診斷(prenataldiagnosis)在胎兒期對(duì)先天性疾病或遺傳性疾病進(jìn)行診斷利用非侵入性或侵入性手段對(duì)胎兒進(jìn)行特異性檢查判斷胎兒的染色體或基因是否正常