RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)課件

血細(xì)胞P53基因表達(dá)檢測(cè)

——RT-PCR

湘雅醫(yī)檢1501RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)P53基因P53基因命名該基因編碼一種分子量為53kDa的蛋白質(zhì)功能作用重要的抑癌基因，防止癌變細(xì)胞基因的修復(fù)功能RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)RT-PCRRT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù))RNA的反轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)在GenBank中查找p53基因設(shè)計(jì)引物確定參數(shù)檢測(cè)p53基因在血細(xì)胞中的表達(dá)反轉(zhuǎn)錄的引物五個(gè)主要問(wèn)題基因表達(dá)的檢測(cè)方法RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)基因表達(dá)的檢測(cè)方法QuesRT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)在蛋白質(zhì)水平基因檢測(cè)的方法在DNA水平在mrna水平Northern印記雜交RT-PCR.......RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)ReverseTranscriptionPCR

RNA提取cDNA反轉(zhuǎn)錄PCRNorthern印記雜交Northern印記雜交基因表達(dá)水平隨機(jī)六核苷酸引物引導(dǎo)Oligo(dT)引導(dǎo)特異性引導(dǎo)RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)反轉(zhuǎn)錄QuesRT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：(1)依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA雜合體中的RNA；(3)依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA.

RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)反轉(zhuǎn)錄可用的引物010305

Oligo(dT)：是一種對(duì)mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3’端Poly(A)尾，此引物與其配對(duì)，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。

隨機(jī)六聚體引物：用此種方法時(shí)，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴(kuò)增過(guò)程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來(lái)源于rRNA。特異性引物：用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)GENBANK中查找P53基因QuesRT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)查找P53序列使用genbank，p53登陸號(hào)AH007667/genbankRT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)查找P53序列RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)查找P53序列RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)查找P53序列RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)引物設(shè)計(jì)的原則15263748引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間G+C含量在40%~60%之間堿基要隨機(jī)分布引物自身及之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)引物5′端可以修飾引物3’端不可修飾引物3′端要避開(kāi)密碼子的第3位RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)設(shè)計(jì)引物確定參數(shù)QuesRT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)引物設(shè)計(jì)Primerpremier5.0Primer

Premier5.0是由加拿大的Premier公司開(kāi)發(fā)的專業(yè)用于PCR或測(cè)序引物以及雜交探針的設(shè)計(jì)、評(píng)估的軟件，其主要界面分為序列編輯窗口（Genetank），引物設(shè)計(jì)窗口（Primer

Design），酶切分析窗口（Restriction

Sites）和紋基分析窗口（Motif），這里我們主要介紹其引物設(shè)計(jì)功能。RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)引物設(shè)計(jì)1啟動(dòng)界面RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)引物設(shè)計(jì)2在此輸入需擴(kuò)增的DNA序列RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)引物設(shè)計(jì)3RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)引物設(shè)計(jì)4RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)引物設(shè)計(jì)5RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)引物設(shè)計(jì)6RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)引物設(shè)計(jì)7RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)引物設(shè)計(jì)8Hairpin：發(fā)夾結(jié)構(gòu)Dimer：二聚體FalsePriming：錯(cuò)配CrossDimer：交叉二聚體RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)引物設(shè)計(jì)9RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)引物設(shè)計(jì)10RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)引物設(shè)計(jì)11保存選擇滿意的引物RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)引物設(shè)計(jì)12所選引物RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)確定參數(shù)cDNAsize:434bp94度30秒變性155度45秒退火273度60秒延伸327次循環(huán)4RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)確定參數(shù)四項(xiàng)參數(shù)循環(huán)次數(shù)退火延伸變性模板DNA由雙鏈變成單鏈，有利于與引物結(jié)合?？筛鶕?jù)模板的復(fù)雜程度調(diào)整變性溫度和時(shí)間，一般情況下94

C30秒可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性。變性的DNA快速冷卻至40－60

C可使引物和模板DNA發(fā)生結(jié)合?？筛鶕?jù)引物的長(zhǎng)度和G＋C的含量選擇復(fù)性溫度一般是70－75

C，此時(shí)TaqDNA聚合酶活性最高。<1kb，1分鐘；>1kb的可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。理論上20－25個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物的累計(jì)即可達(dá)到最大值、實(shí)際操作中25－30較合理。RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)確定參數(shù)退火溫度：50℃~54℃RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)檢測(cè)p53基因的表達(dá)QuesRT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)檢測(cè)基因的表達(dá)根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度制作適宜濃度的瓊脂糖凝膠，取適量PCR產(chǎn)物，加上樣緩沖液充分混合，點(diǎn)樣于事先做好的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，10V/cm電泳45－60min。成像系統(tǒng)成像分析。瓊脂糖凝膠電泳分離產(chǎn)物：RT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)檢測(cè)基因的表達(dá)1234Marker（