基因組學考試重點

第一章大規(guī)?；蚪M測序的原理與方法1、基因組學是要揭示下述四種整合體系的相互關系:〔1〕基因組作為信息載體〔堿基對、重復序列的整體守恒與局部不平衡的關系〕〔2〕基因組作為遺傳物質的整合體(基因作為功能和結構單位與遺傳學機制的關系)〔3〕基因組作為生物化學分子的整合體(基因產(chǎn)物作為功能分子與分子、細胞機制的關系〕〔4〕物種進化的整合體(物種在地理與大氣環(huán)境中的自然選擇〕2、為什么說基因組學是一門大科學？〔1〕“界門綱目科屬種〞，地球上現(xiàn)存物種近億，所有生生滅滅的生物，無一例外，都有個基因組?！?〕基因組作為信息載體，它所儲存的信息是最根本的生物學信息之一；既是生命本質研究的出發(fā)點之一，又是生物信息的歸宿?！?〕基因組學研究包括對基因產(chǎn)物〔轉錄子組和蛋白質組〕的系統(tǒng)生物學研究?！?〕基因多態(tài)性的規(guī)?；芯烤褪腔蚪M多態(tài)性的研究?！?〕基因組學的研究必然要上升到細胞機制、分子機制和系統(tǒng)生物學的水平?！?〕基因組的起源與進化和物種的起源與進化一樣是一個新的科學領域。〔7〕基因組信息正在以天文數(shù)字計算，規(guī)模化地積累，它的深入研究必將形成一個嶄新的學科?！?〕基因組的信息是用來發(fā)現(xiàn)和解釋具有普遍意義的生命現(xiàn)象和它們的變化、內(nèi)在規(guī)律、和相互關系?！?〕基因組的信息含量高?；蚪M學的研究又在于基因組間的比較?！?0〕基因組學的復雜性必然導致多學科的引進和介入〔各生物學科、醫(yī)學、藥學、計算機科學、化學、數(shù)學、物理學、電子工程學、考古學等〕。〔11〕基因組學研究的手段和技術已經(jīng)走在生命科學研究的最前沿。〔12〕基因組信息來自于高效率和規(guī)?；a(chǎn)生的實驗數(shù)據(jù)。〔13〕人類基因組方案證明了基因組研究的迫切性和可行性。3、大規(guī)?；蚪M測序的幾個支撐技術是什么？〔1〕Sanger雙脫氧末端終止法雙脫氧終止法，即sanger測序法，是根據(jù)DNA在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進行熒光標記，產(chǎn)生以A、T、C、G結束的四組不同長度的一系列DNA片段，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見的DNA堿基序列。通俗點說，就是通過電泳的方法將一系列DNA片段從小到大排列起來，由于每條片段末尾都含有熒光標記的堿基，通過放射性自顯影，即可讀出這些堿基的種類，這些堿基的排列順序，就是待測DNA的序列?！?〕PCR技術聚合酶鏈式反響〔PCR〕是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火〔復性〕及適溫延伸等幾步反響組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它不僅可用于基因別離、克隆和核酸序列分析等根底研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶鏈式反響〔PolymeraseChainReaction，簡稱PCR〕又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術?！?〕DNA自動測序儀的開展DNA序列測定分手工測序和自動測序，手工測序包括sanger雙脫氧鏈終止法和maxam-gilbert化學降解法。自動化測序實際上已成為當今dna序列分析的主流。美國peabi公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等dna測序儀，其中310型是臨床檢測實驗室中使用最多的一種型號。本實驗介紹的是abiprism310型dna測序儀的測序原理和操作規(guī)程?！?〕生物信息學分析軟件硬件設備4、大規(guī)模基因組測序的兩種策略是什么？二者有何區(qū)別？〔1〕逐步克隆法〔ClonebyClone〕〔2〕全基因組霰彈法〔WholeGenomeShot-gun〕〔3〕二者的比較：項目策略全基因組霰彈法逐步克隆法遺傳背景不需要需要〔需構建精確的物理圖譜〕速度快慢費用低高計算機性能高〔以全基因組為單位進行拼接〕低〔以BAC為單位進行拼接〕適用范圍工作框架圖精細圖代表測序物種果蠅、水稻人、線蟲5、人類基因組方案所構建的四張圖是什么？〔1〕遺傳圖譜：又稱為連鎖圖譜〔linkagemap〕，指基因或DNA標志在染色體上的相對位置與遺傳距離。〔2〕物理圖譜：以定位的DNA標記序列如STS作為路標，以DNA實際長度即bp、kb、Mb為圖距的基因組圖譜?！?〕轉錄圖譜：利用EST〔expressedsequencetags表達序列標簽〕作為標記所構建的分子遺傳圖譜?！?〕序列圖譜：通過基因組測序得到的，以A、T、G、C為標記單位的基因組DNA序列。6、STS的定義，原理、要滿足的條件及其來源?！?〕序列標記位點(STS)是一段短的DNA序列，通常長度在100到500bp，易于識別，僅存在于待研究的染色體或基因組中。作一套STS圖譜需要收集來自單條染色體或一個完整基因組的重疊的DNA片段。在圖1中，從單條染色體中制備一組DNA片段，使染色體上每一點平均有5條片段對應。收集作圖必需的數(shù)據(jù)時，須排列每一STS，了解哪些片段包含有哪些STS。這可以通過雜交分析來完成，但通常使用PCR方法，因為PCR更快捷，更易于自動化，兩個STS共存于同—個片段的機率依賴于它們在基因組中的相近程度。如果它們相當接近、它們存在于同一片段的時機就相當大；而如果它們位置相對分開，有時它們會在同一片段上，有時那么不會(圖1)。因此，這些資料可用來計算兩個標記間的距離，其方式與計算連鎖分析中計算圖距的方式相同；在連鎖分析中，兩個標記間的圖距是根據(jù)它們的交換頻率來計算的。STS作圖與其相比、不同之處僅在于兩個標記間的圖距是根據(jù)別離頻率來計算的?！?〕這些片段覆蓋染色體的全長，染色體上每一點平均有五條片段相對應，染色體圖譜上兩個接近的標記共同存在于一條片段的可能性就高，相隔較遠的標記位于同一條片段中的可能性就較小?！?〕一個DNA序列要成為STS，須滿足兩個前提。首先它的序列必須是己知的，以便于用PCR方法檢測STS在不同DNA片段中存在與否。第二個要求是STS必須在待研究的染色體上有唯一的定位，或當DNA片段群覆蓋全基因組時，STS在整個基因組中具有唯一的定位位點。如果STS序列具有多個定位點，那么作圖數(shù)據(jù)將會模糊不清。因此需要確保STS不包含重復DNA的序列?！?〕上述兩個前提易于滿足，因此可以通過多種途徑獲得STS，最常見的來源是：①表達序列標記：表達序列際記(expressedscquencetag,E5T)是通過互補DNA(cDNA)克隆分析獲得的短序列。制備互補DNA是將mRNA轉化成雙鏈DNA.由于細胞中mRNA來自于編碼蛋白的基因，故此cDNA代表了mRNA來源的細胞中表達的基因序列。EST被看做獲得重要基因序列的快捷途徑。即使其序列不完整，也仍然有價值。如果EST來自于單一序列DNA，不是基因家族中的某一成員，它也可以被用作STS。而所謂基因家族是指一組具有相同或相近序列的基因。②遺傳標記序列：如微衛(wèi)星標記。③隨機基因組序列可以通過對克隆的基因組DNA的隨機小片段進行測序或在數(shù)據(jù)庫中搜尋貯存序列獲得。7、逐步克隆法包括哪幾個步驟？〔1〕物理圖譜的構建——序列標簽位點作圖①確定各STS序列及其在基因組中的位置；②大插入片段基因組文庫的構建；〔BAC文庫的構建P25〕③以特定STS為標記篩選并定位克隆；④含有STS的克隆在基因組中的排序。經(jīng)過這幾個步驟，以定位的DNA標記序列〔STS〕作為路標，以DNA實際長度即bp、kb、Mb為圖距的基因組圖譜便構建完成了。此時我們?nèi)匀徊恢谰唧w的序列信息。只知道STS的序列和位置，以及STS間的距離?！?〕大片段克隆的篩選〔P36；STS-PCR反響池方案P27〕該步驟包括BAC克隆的篩選和延伸克隆的篩選。前者可使相互間具有重疊片段的BAC克隆根據(jù)STS信息組裝成contig，并定位與基因組上。后者主要是補充基因組中未被BAC文庫覆蓋的克隆序列，常用方法有指紋圖譜法和末端序列步行法。經(jīng)過這一步，我們得到了覆蓋整個基因組全序列的克隆，以備測序。〔3〕霰彈法測序與“工作框架圖〞的構建用霰彈法對篩選到的BAC克隆進行測序，得到大量隨機片段。組裝這些片段，可能會出現(xiàn)如下問題：低堿基質量區(qū)、單鏈區(qū)、序列缺口、未組裝區(qū)。通過重測序等手段對這些區(qū)域進行補充，即所說的Finishing，便可得到高質量的全序列?！?〕序列的全組裝與“完成圖〞構建對測序后的BAC克隆序列進行拼接，完成該基因組的序列圖譜。8、全基因組霰彈法的測序流程？全基因組霰彈法測序的整個流程如下列圖所示〔1〕從頭組裝流程：SolexaPart&454Part〔P31〕〔2〕ReadsProcess流程：Solexaand454〔P31-32〕〔3〕Hybridassembly和基于EST的組裝〔4〕粗測序reads的預處理P32①意義和目的；②流程；③圖像分析和堿基讀出；④質量控制〔5〕數(shù)據(jù)評價P33①Read質量分布；②文庫插入大?。虎跰appingRate；④二聚體評價〔6〕用Kmer估計基因組大小〔7〕基因組混合拼接驗證及結構變異檢測流程〔8〕重復序列注釋流程〔9〕基因結構及功能注釋技術路線〔GeneOntologyandKEGG〕9、Kmer介紹〔1〕

定義：就是一個長度為K的DNA序列，K通常取17?！?〕

用途：糾正測序錯誤，估計基因組大小、雜合率、重復序列的含量?！?〕

K-mer分布圖，同樣數(shù)據(jù)量的情況下，峰位決定基因組大小，峰位越靠左，基因組越大。峰值表示大局部K-mer都出現(xiàn)在這個深度?！?〕

峰位上下的影響因素：a、錯誤率，錯誤率越高，起始峰位越高，主峰相對越低；b、重復序列，重復序列越多，主峰下降越慢。〔5〕

雜合率越高，那么雜合峰越高，雜合峰出現(xiàn)在主峰的一半處，按照雜合峰大小估計基因組大小，基因組大小等于二倍雜合峰?！?〕

假設一條reads長45bp，K=17，那么每個Reads產(chǎn)生的K-mer數(shù)=45-17+1

假設測序深度為10×，那么K-mer實際覆蓋深度=10*〔45-17+1〕/45

〔7〕

基因組大?。杭僭O在主峰頂端對應的K-mer次數(shù)為15，實際測序量為100G，那么基因組大小=100*〔45-17+1〕/45/15〔8〕

不能直接根據(jù)雜合峰和主峰的高度估計基因組的雜合率大小，只能通過模擬數(shù)據(jù)，再用實際數(shù)據(jù)與模擬數(shù)據(jù)進行比較，找出最接近的一個，來推測基因組的雜合率大小。〔9〕

測序深度越低，雜合峰與主峰越接近y軸，隨著測序深度的增加，會將雜合峰和主峰展開，容易看出雜合峰與主峰的關系。〔10〕純下降的K-mer圖，原因可以能是數(shù)據(jù)量不夠；假設開始下降后來有峰的K-mer圖，前面下降的地方可能是測序錯誤。〔11〕當數(shù)據(jù)量超過K-mer最高值〔255M〕時，那么無峰。第二章新一代測序技術一、第一代測序技術簡介※Sanger測序法〔雙脫氧核糖核苷酸末端終止法〕的原理？Sanger法是根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進行熒光標記，產(chǎn)生以A、T、C、G結束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見的DNA堿基序列。

Sanger法測序的原理就是，每個反響含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之擴增，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)使之終止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止，終止點由反響中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反響得到一組長幾個至千以上個，相差一個堿基一系列片斷。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳別離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。二、第二代測序技術1.概述DNA測序〔DNAsequencing〕作為一種重要的實驗技術，在生物學研究中有著廣泛的應用。早在DNA雙螺旋結構〔WatsonandCrick,1953)被發(fā)現(xiàn)后不久就有人報道過DNA測序技術，但是當時的操作流程復雜，沒能形成規(guī)模。隨后在1977年Sanger創(chuàng)造了具有里程碑意義的末端終止測序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert創(chuàng)造了化學降解法。Sanger法因為既簡便又快速，并經(jīng)過后續(xù)的不斷改進，成為了迄今為止DNA測序的主流。然而隨著科學的開展，傳統(tǒng)的Sanger測序已經(jīng)不能完全滿足研究的需要，對模式生物進行基因組重測序以及對一些非模式生物的基因組測序，都需要費用更低、通量更高、速度更快的測序技術，第二代測序技術〔Next-generationsequencing)應運而生。第二代測序技術的核心思想是邊合成邊測序〔SequencingbySynthesis)，即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列，現(xiàn)有的技術平臺主要包括Roche/454FLX、Illumina/SolexaGenomeAnalyzer和AppliedBiosystemsSOLIDsystem。這三個技術平臺各有優(yōu)點，454FLX的測序片段比較長，高質量的讀長〔read〕能到達400bp；Solexa測序性價比最高，不僅機器的售價比其他兩種低，而且運行本錢也低，在數(shù)據(jù)量相同的情況下，本錢只有454測序的1/10；SOLID測序的準確度高，原始堿基數(shù)據(jù)的準確度大于99.94%，而在15X覆蓋率時的準確度可以到達99.999%，是目前第二代測序技術中準確度最高的。雖然第二代測序技術的工作一般都由專業(yè)的商業(yè)公司來完成，但是了解測序原理、操作流程等會對后續(xù)的數(shù)據(jù)分析有很重要的作用，下文將以Illumina/SolexaGenomeAnalyzer測序為例，簡述第二代測序技術的根本原理、操作流程等方面。2.根本原理Illumina/SolexaGenomeAnalyzer測序的根本原理是邊合成邊測序。在Sanger等測序方法的根底上，通過技術創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標記四種不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號并經(jīng)過特定的計算機軟件處理，從而獲得待測DNA的序列信息。3.操作流程〔1〕測序文庫的構建〔LibraryConstruction〕首先準備基因組DNA〔雖然測序公司要求樣品量要到達200ng，但是GnomeAnalyzer系統(tǒng)所需的樣品量可低至100ng,能應用在很多樣品有限的實驗中〕，然后將DNA隨機片段化成幾百堿基或更短的小片段，并在兩頭加上特定的接頭〔Adaptor〕。如果是轉錄組測序，那么文庫的構建要相對麻煩些，RNA片段化之后需反轉成cDNA，然后加上接頭，或者先將RNA反轉成cDNA，然后再片段化并加上接頭。片段的大小〔Insertsize〕對于后面的數(shù)據(jù)分析有影響，可根據(jù)需要來選擇。對于基因組測序來說，通常會選擇幾種不同的insertsize，以便在組裝〔Assembly〕的時候獲得更多的信息?！?〕錨定橋接〔SurfaceAttachmentandBridgeAmplification〕Solexa測序的反響在叫做flowcell的玻璃管中進行，flowcell又被細分成8個Lane，每個Lane的內(nèi)外表有無數(shù)的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA片段變性成單鏈后與測序通道上的接頭引物結合形成橋狀結構，以供后續(xù)的預擴增使用?！?〕預擴增〔DenaturationandCompleteAmplification〕添加未標記的dNTP和普通Taq酶進行固相橋式PCR擴增，單鏈橋型待測片段被擴增成為雙鏈橋型片段。通過變性，釋放出互補的單鏈，錨定到附近的固相外表。通過不斷循環(huán)，將會在Flowcell的固相外表上獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段。〔4〕單堿基延伸測序〔SingleBaseExtensionandSequencing〕在測序的flowcell中參加四種熒光標記的dNTP、DNA聚合酶以及接頭引物進行擴增，在每一個測序簇延伸互補鏈時，每參加一個被熒光標記的dNTP就能釋放出相對應的熒光，測序儀通過捕獲熒光信號，并通過計算機軟件將光信號轉化為測序峰，從而獲得待測片段的序列信息。從熒光信號獲取待測片段的序列信息的過程叫做BaseCalling，Illumina公司BaseCalling所用的軟件是Illumina’sGenomeAnalyzerSequencingControlSoftwareandPipelineAnalysisSoftware。讀長會受到多個引起信號衰減的因素所影響，如熒光標記的不完全切割。隨著讀長的增加，錯誤率也會隨之上升?！?〕數(shù)據(jù)分析〔DataAnalyzing〕這一步嚴格來講不能算作測序操作流程的一局部，但是只有通過這一步前面的工作才顯得有意義。測序得到的原始數(shù)據(jù)是長度只有幾十個堿基的序列，要通過生物信息學工具將這些短的序列組裝成長的Contigs甚至是整個基因組的框架，或者把這些序列比對到已有的基因組或者相近物種基因組序列上，并進一步分析得到有生物學意義的結果。4、二代測序技術總結〔1〕需熒光或者化學放光物質；〔2〕需聚合酶或者連接酶；〔3〕較昂貴的試劑耗材和光學系統(tǒng)；〔4〕強大的圖像分析計算能力。三、454技術平臺簡介〔焦磷酸測序法〕1、化學原理焦磷酸測序是由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶〔ATPsulfurylase〕、熒光素酶〔luciferase〕和雙磷酸酶〔apyrase〕4種酶催化同一反響體系的酶級聯(lián)化學發(fā)光反響，反響底物5’-磷酰硫酸〔APS〕和熒光素。反響體系還包括待測序DNA單鏈和測序引物。在每一輪測序反響中，參加1種dNTP，假設該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放等摩爾數(shù)的焦磷酸基團〔PPi〕。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驅動熒光素酶介導的熒光素向氧化熒光素的轉化，發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號，并由Pyrogram軟件轉化為一個峰值，其高度與反響中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。根據(jù)參加dNTP類型和熒光信號強度就可以實時記錄模板DNA的核苷酸序列。2、測序技術流程〔1〕文庫構建①基因組DNA片段化〔fragmentation〕及評估；②DNA片段末端平齊化〔endpolishing〕：為接頭的添加反響做準備；③接頭連接：添加接頭A和B。④文庫固定化：DNA片段通過接頭連接到微珠上。⑤補充反響〔Fall-inReaction〕：修補連接到微珠上的DNA片段的鏈缺口。⑥DNA雙鏈別離，DNA片段以單鏈形式結合在微珠上?！鵓39末端配對文庫制備兩張圖詳細介紹了文庫構建步驟?！?〕文庫模板擴增EmulsionPCR:ahighefficientwayofPCRamplificationofrandomDNAlibrariesinaptamerselection.在得到僅有AB銜接子單鏈的DNA模板后，此DNA模板可與過量DNA不做珠子退火結合，并被吸附到一種用于PCR反響的有水混合物小滴上，此混合物包含了PCR反響所必需的各種試劑，在適宜條件進行擴增，最后可對結合的大量DNA鏈的珠子進行富集?！?〕測序反響〔4〕成像：信號強度圖譜?！?〕測序數(shù)據(jù)的處理3、454測序技術優(yōu)缺點四、Illumina測序技術平臺〔聚合酶合成測序〕1、技術原理及流程〔1〕文庫制備將基因組DNA打成幾百個堿基〔或更短〕的小片段，在片段的兩個末端加上接頭(adapter)。〔2〕產(chǎn)生DNA簇利用專利的芯片，其外表連接有一層單鏈引物，DNA片段變成單鏈后通過與芯片外表的引物堿基互補被一端“固定〞在芯片上。另外一端〔5’或3’〕隨機和附近的另外一個引物互補，也被“固定〞住，形成“橋(bridge)“。反復30輪擴增，每個單分子得到了1000倍擴增，成為單克隆DNA簇。DNA簇產(chǎn)生之后，擴增子被線性化，測序引物隨后雜交在目標區(qū)域一側的通用序列上?！?〕測序GenomeAnalyzer系統(tǒng)應用了邊合成邊測序〔SequencingBySynthesis〕的原理。參加改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP。這些核苷酸是“可逆終止子〞，因為3’羥基末端帶有可化學切割的局部，它只容許每個循環(huán)摻入單個堿基。此時，用激光掃描反響板外表，讀取每條模板序列第一輪反響所聚合上去的核苷酸種類。之后，將這些基團化學切割，恢復3'端粘性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸。如此繼續(xù)下去，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣，統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結果，就可以得知每個模板DNA片段的序列。目前的配對末端讀長可到達2×50bp，更長的讀長也能實現(xiàn)，但錯誤率會增高。讀長會受到多個引起信號衰減的因素所影響，如熒光標記的不完全切割?！?〕數(shù)據(jù)分析自動讀取堿基，數(shù)據(jù)被轉移到自動分析通道進行二次分析。2、Solexa測序技術的優(yōu)缺點P423、Illumina技術應用4、Illumina測序相關數(shù)據(jù)處理軟件五、SOLiD測序〔SequencingbyOligonucleotideLigationandDetection〕1、SOLiD工作流程〔1〕文庫制備SOLiD系統(tǒng)能支持兩種測序模板：片段文庫(fragmentlibrary)或配對末端文庫(mate-pairedlibrary)。使用哪一種文庫取決于你的應用及需要的信息。片段文庫就是將基因組DNA打斷，兩頭加上接頭，制成文庫。如果你想要做轉錄組測序、RNA定量、miRNA探索、重測序、3’,5’-RACE、甲基化分析、ChIP測序等，就可以用它。如果你的應用是全基因組測序、SNP分析、結構重排/拷貝數(shù)，那么需要用配對末端文庫。配對末端文庫是將基因組DNA打斷后，與中間接頭連接，再環(huán)化，然后用EcoP15酶切，使中間接頭兩端各有27bp的堿基，再加上兩端的接頭，形成文庫。〔2〕乳液PCR/微珠富集在微反響器中參加測序模板、PCR反響元件、微珠和引物，進行乳液PCR〔EmulsionPCR〕。PCR完成之后，變性模板，富集帶有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。微珠上的模板經(jīng)過3’修飾，可以與玻片共價結合?？吹竭@里，是不是有一種似曾相識的感覺呢？那就對了，此步驟與454的GSFLX根本相同。不過SOLiD系統(tǒng)的微珠要小得多，只有1um。乳液PCR最大的特點是可以形成數(shù)目龐大的獨立反響空間以進行DNA擴增。其關鍵技術是“注水到油〞，根本過程是在PCR反響前，將包含PCR所有反響成分的水溶液注入到高速旋轉的礦物油外表，水溶液瞬間形成無數(shù)個被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構成了獨立的PCR反響空間。理想狀態(tài)下，每個小水滴只含一個DNA模板和一個P1磁珠，由于水相中的P2引物和磁珠外表的P1引物所介導的PCR反響，這個DNA模板的拷貝數(shù)量呈指數(shù)級增加，PCR反響結束后，P1磁珠外表就固定有拷貝數(shù)目巨大的同來源DNA模板擴增產(chǎn)物?！?〕微珠沉積3’修飾的微珠沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個、4個或8個測序區(qū)域。SOLiD系統(tǒng)最大的優(yōu)點就是每張玻片能容納更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實現(xiàn)更高的通量?！?〕連接測序這一步可就是SOLiD的獨門秘笈了。它的獨特之處在于沒有采用慣常的聚合酶，而用了連接酶。SOLiD連接反響的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物。連接反響中，這些探針按照堿基互補規(guī)那么與單鏈DNA模板鏈配對。探針的5’末端分別標記了CY5、TexasRed、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料。探針3’端1～5位為隨機堿基，可以是ATCG四種堿基中的任何一種堿基，其中第1、2位構成的堿基對是表征探針染料類型的編碼區(qū)，下列圖的雙堿基編碼矩陣規(guī)定了該編碼區(qū)16種堿基對和4種探針顏色的對應關系，而3～5位的“n〞表示隨機堿基，6～8位的“z〞指的是可以和任何堿基配對的特殊堿基。單向SOLiD測序包括五輪測序反響，每輪測序反響含有屢次連接反響。第一輪測序的第一次連接反響由連接引物“n〞介導，由于每個磁珠只含有均質單鏈DNA模板，所以這次連接反響摻入一種8堿基熒光探針，SOLiD測序儀記錄下探針第1、2位編碼區(qū)顏色信息，隨后的化學處理斷裂探針3’端第5、6位堿基間的化學鍵，并除去6~8位堿基及5’末端熒光基團，暴露探針第5位堿基5’磷酸，為下一次連接反響作準備。因為第一次連接反響使合成鏈多了5個堿基，所以第二次連接反響得到模板上第6、7位堿基序列的顏色信息，而第三次連接反響得到的是第11、12位堿基序列的顏色信息……幾個循環(huán)之后，引物重置，開始第二輪的測序。由于第二輪連接引物n-1比第一輪錯開一位，所以第二輪得到以0，1位起始的假設干堿基對的顏色信息。五輪測序反響反響后，按照第0、1位，第1、2位...…的順序把對應于模板序列的顏色信息連起來，就得到由“0，1，2，3…〞組成的SOLiD原始顏色序列。〔5〕數(shù)據(jù)分析SOLiD測序完成后，獲得了由顏色編碼組成的SOLiD原始序列。理論上來說，按照“雙堿基編碼矩陣〞，只要知道所測DNA序列中任何一個位置的堿基類型，就可以將SOLiD原始顏色序列“解碼〞成堿基序列。但由于雙堿基編碼規(guī)那么中雙堿基與顏色信息的簡并特性〔一種顏色對應4種堿基對〕，前面堿基的顏色編碼直接影響緊跟其后堿基的解碼，所以一個錯誤顏色編碼就會引起“連鎖解碼錯誤〞，改變錯誤顏色編碼之后的所有堿基。和其它所有測序儀一樣，測序錯誤在所難免，關鍵是對測序錯誤的評價和后續(xù)處理。由于SOLiD系統(tǒng)采用了雙堿基編碼技術，在測序過程中對每個堿基判讀兩遍，從而減少原始數(shù)據(jù)錯誤，提供內(nèi)在的校對功能。這樣，雙保險確保了SOLiD系統(tǒng)原始堿基數(shù)據(jù)的準確度大于99.94%，而在15X覆蓋率時的準確度可以到達99.999%，是目前新一代基因分析技術中準確度最高的。為防止“連鎖解碼錯誤〞的發(fā)生，SOLiD數(shù)據(jù)分析軟件不直接將SOLiD原始顏色序列解碼成堿基序列，而是依靠reference序列進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。SOLiD序列分析軟件首先根據(jù)“雙堿基編碼矩陣〞把reference堿基序列轉換成顏色編碼序列，然后與SOLiD原始顏色序列進行比較，來獲得SOLiD原始顏色序列在reference的位置，及兩者的匹配性信息。Reference轉換而成的顏色編碼序列和SOLiD原始序列的不完全匹配主要有兩種情況：“單顏色不匹配〞和“兩連續(xù)顏色不匹配〞。由于每個堿基都被獨立地檢測兩次，且SNP位點將改變連續(xù)的兩個顏色編碼，所以一般情況下SOLiD將單顏色不匹配處理成測序錯誤，這樣一來，SOLiD分析軟件就完成了該測序錯誤的自動校正；而連續(xù)兩顏色不匹配也可能是連續(xù)的兩次測序錯誤，SOLiD分析軟件將綜合考慮該位置顏色序列的一致性及質量值來判斷該位點是否為SNP。2、SOLiD優(yōu)勢和劣勢3、SOLiD測序法的應用〔1〕測序和重測序〔2〕全基因表達圖譜分析芯片大概是目前應用最廣泛的從全局角度分析基因表達整體模式的方法。然而，基于雜交技術的微陣列技術只限用于序列，無法檢測新的mRNA；而且雜交技術靈敏度有限，難以檢測低豐度的目標〔需要更多的樣品量〕，難以檢測重復序列；也無法捕捉到目的基因表達水平的微小變化而這恰恰是研究在刺激下或環(huán)境變化時的生物反響所必需的。與芯片技術相比，基于測序的高靈敏SOLiD技術可對單個細胞和癌癥樣品中存在的痕量RNA進行整體的全基因組表達圖譜分析，每次運行能定位高達2億4千萬個標簽〔mRNA的相對表達水平可通過系統(tǒng)產(chǎn)生的序列標簽數(shù)目來計算〕，可檢測低至每個細胞中10-40pg的總RNA，即使mRNA表達水平很低，SOLiD系統(tǒng)也能夠無偏向性地分析樣品中存在的和未知mRNA，從而定量特定mRNA的差異表達模式。起始樣品比微陣列技術要少得多，尤其適用于來源極為有限的生物樣品分析，如癌癥干細胞分析其基因和非編碼RNA的表達圖譜有助于有助于加速開掘潛在的生物標志物，從而更準確區(qū)分不同的疾病類型以及識別疾病易感性，幫助于研究人員更好地了解病變細胞的特性?！?〕更多RNA研究除了單細胞基因表達圖譜分析，SOLiD系統(tǒng)在RNA方面的其他應用還包括利用SOLiDSmallRNAExpressionKit來發(fā)現(xiàn)和篩選小分子RNA，實現(xiàn)在無需預先知道序列信息的情況下高通量發(fā)現(xiàn)新的RNA分子。這個方案有望顯著地提高研究人員鑒別小分子RNA的能力，將過去不可能完成的實驗變?yōu)榭赡堋Ｄ壳耙寻l(fā)現(xiàn)的microRNAs還非常有限，SOLiD可在不知道目標分子DNA序列的情況下進行檢測和定量小的RNA分子，可將樣品制備工作從常規(guī)方法的四天縮短為僅需一天，是分析在生物樣品中表達的和未知miRNA及其它小分子RNAs的有效工具。利用SOLiDWholeTranscriptomeKit還可以探索和鑒定全轉錄本。SOLiD無可比較的高通量和測序數(shù)據(jù)的高精確性使得可以用短序列讀長即可測序整個轉錄組。了解轉錄組對有助于解開導致復雜疾病的分子通路的秘密。這一系列應用補充使研究人員能在單個超高通量平臺上開展綜合的RNA研究?！?〕SNP分析盡管絕大多數(shù)的人類遺傳信息在所有人中都相同，但是研究人員通常更感興趣的是研究個體之間微小的遺傳差異。這種差異包括單堿基變異，以及被稱為結構變異的各種較大片段DNA序列變異。結構變異包括DNA片段的插入、缺失、倒位和易位，結構變異的DNA片段范圍可從幾個堿基對到數(shù)百萬個堿基對，可能對基因產(chǎn)生重要影響，并導致人類疾病的發(fā)生。SOLiD流程獲得的嚴密的片段范圍，使研究人員可以鑒別出很寬范圍內(nèi)的插入和缺失片段，結構重排也能很容易鑒別出來。這個平臺的超高通量使研究人員可輕而易舉地獲得高度基因組覆蓋率的數(shù)據(jù)，精確鑒定個體基因組中存在的數(shù)百萬個單堿基多態(tài)性SNP，揭示大量此前未知、具有潛在醫(yī)學價值的遺傳變異，從而促進我們對正常/疾病狀態(tài)下DNA結構變異的了解，以及在更高的分辨率下對結構變異進行深入分析，解釋個體之間的易感性差異和對疾病治療應答的差異，最終實現(xiàn)個性化醫(yī)療?！?〕甲基化分析甲基化是自然發(fā)生的DNA化學修飾的一種。抑癌基因的失活與DNA序列特定區(qū)域的甲基化有關。而去甲基化那么可能導致基因組不穩(wěn)定和表達模式變化。DNA甲基化區(qū)域可能作為基因在癌癥過程中的標記。研究人員一直致力研究從正常到癌變過程中甲基化模式如何變化的，原癌基因異常甲基化模式在癌變過程中扮演怎樣的角色。SOLiD系統(tǒng)運行通量非常驚人，很快就可以做多個樣本全基因組甲基化模式檢測，使得研究人員可以鑒別基因組中對應元件的甲基化狀態(tài)，從而幫助研究人員檢測甲基化模式是否可以作為癌癥的生物標識，以及更好了解甲基化在癌變過程中扮演的角色。六、RNA文庫構建策略比較1、SOLiDmiRNA文庫構建2、SOLiDRNA-seq文庫構建策略3、SolexasmallRNA文庫測序策略4、SolexaTranscriptome文庫構建策略七、第三代測序技術展望1、非光學顯微鏡成像2、納米孔技術3、半導體技術第三章基因轉錄組的測定及分析一、大規(guī)模表達序列標簽〔EST〕測定及分析1、什么是EST？ESTs〔ExpressedSequencetags〕是從已建好的cDNA庫中隨機取出一個克隆，從5’末端或3’末端對插入的cDNA片段進行一輪單向自動測序，所獲得的約60-500bp的一段cDNA序列。2、EST的應用？〔1〕基因識別包括：①在同一物種中搜尋基因家族的新成員；②在不同物種間搜尋功能相同的基因；③基因的不同剪切模式的搜尋?！?〕基因圖譜的繪制〔3〕基因預測〔4〕SNPs的發(fā)現(xiàn)〔5〕利用ESTs大規(guī)模分析基因表達水平：①癌癥基因組解析方案CGAP；②基因表達系列分析SAGE；③DNA微陣列或基因芯片的研究。3、幾種大規(guī)模分析基因表達水平的方法？〔1〕EST技術流程P2-4〔2〕基因表達系列分析〔SAGE〕技術流程與分析流程P2-5,6,7.〔3〕基因芯片或微陣列技術流程P2-8幾種大規(guī)模分析基因表達水平的方法的比較：4、ESTs數(shù)據(jù)的缺乏有哪些？P3-15、EST序列測定及分析的技術路線？〔1〕cDNA文庫的構建：種類、常見問題及其原因。P3-4,5,6.〔2〕測序方向的選擇：取決于實驗目的?！?〕測序及對測序結果的前處理：①去除低質量序列；②屏蔽贗象序列；③去除鑲嵌克?。虎苋コL度小于100bp的序列?！?〕文庫質量檢驗、序列質量檢驗?！?〕ESTs的聚類和拼接：①聚類的目的和作用；②不嚴格的和嚴格的聚類，有參照的和無參照的聚類；③常用的拼接軟件。④拼接：即Cluster的連接。利用cDNA克隆的信息和5’，3’端Reads的信息，不同的Cluster可以連接在一起。常用的拼接工具有UniGene，TIGRGeneIndex和STACK?！?〕基因注釋及功能分類：①基因注釋流程；②基因功能分類〔手工分類、計算機批量處理、基因產(chǎn)物直系同源簇的分析〔簡稱COG，如EST的代謝途徑分析KEGG〕〕?！?〕后續(xù)分析：比較基因組學分析、基因表達譜分析、新基因研究、基因可變剪切分析、實驗驗證〔MicroArray，GeneChip，RT-PCR，NorthernBlotting〕。二、利用新一代測序儀進行轉錄組學的研究1、轉錄組測序〔RNAseq〕〔1〕測序對象：轉錄組測序一般是對用多聚胸腺嘧啶〔oligo-dT〕進行親和純化的RNA聚合酶II轉錄生成的成熟mRNA和ncRNA進行高通量測序?！?〕優(yōu)勢：相對于傳統(tǒng)的芯片雜交平臺，轉錄組測序無需預先針對序列設計探針，即可對任意物種的整體轉錄活動進行檢測，提供更精確的數(shù)字化信號，更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍，是目前深入研究轉錄組復雜性的強大工具。〔3〕轉錄組測序與基因表達譜的區(qū)別：轉錄組測序技術是把mRNA,smallRNA,andNONcodingRNA等用高通量測序技術把它們的序列測出來。全面快速地獲取某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉錄本。反映出它們的表達水平。基因表達譜指通過構建處于某一特定狀態(tài)下的細胞或組織的非偏性cDNA文庫,大規(guī)模cDNA測序,收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群體組成,從而描繪該特定細胞或組織在特定狀態(tài)下的基因表達種類和豐度信息，這樣編制成的數(shù)據(jù)表就稱為基因表達譜。2、轉錄組的定義和組成P73、RNA-seq的生物學重復和標準P74、RNA-seq的流程？〔1〕RNA-seq測序文庫制備對于mRNA-seq實驗，從總RNA到最終的cDNA文庫制備完成主要包括以下步驟。首先，用Poly(T)寡聚核苷酸從總RNA中抽取全部帶Poly(A)尾的RNA，其中的主要局部就是編碼基因所轉錄的mRNA。將所得RNA隨機打斷成片段，再用隨機引物和逆轉錄酶從RNA片段合成cDNA片段。然后，對cDNA片段進行末端修復并連接測序接頭〔adapter〕，得到將用于測序的cDNA。在以上過程，將RNA隨機片段化和采用隨機引物進行反轉錄，都是為了使所得cDNA片段較均勻地取自各個轉錄本。為提高測序效率，一般還需要用電泳切膠法獲取長度范圍在200bp〔±25bp〕的cDNA片段，再通過RCR擴增，得到最終的cDNA文庫。在上述文庫制備過程中，如果不是只抽取帶Poly(A)尾的RNA，而是使用全部的RNA，那么RNA-seq測得的就是細胞中的全部轉錄本；如果把帶Poly(A)尾的RNA過濾掉，也可以得到非編碼的RNA轉錄本；如果從總RNA中只提取長度為21~23個堿基左右的RNA，那么得到全部的miRNA〔microRNA〕轉錄本，相應的方法也稱作miRNA-seq。樣品制備最終得到的是雙鏈cDNA文庫。在后續(xù)測序中，測得的每個讀段〔read〕隨機地來自雙鏈cDNA的某一條鏈，從讀段序列本身無法得知它是與RNA方向相同還是倒轉互補，在后續(xù)的讀段定位時需要兩個方向都考慮。在新基因識別等應用中，轉錄本的方向對基因注釋尤為重要，需要在文庫制備和測序中保存RNA的方向信息。最近有文獻報道了保存方向信息的RNA-seq樣品制備方法?！?〕測序平臺數(shù)據(jù)輸出將RNA-seq測序文庫參加流動槽〔flowcell〕中的各通道〔lane〕，在橋式PCR擴增后，就可以進行測序了。測序過程中，計算機軟件同步地對熒光圖像數(shù)據(jù)進行處理，通過分析熒光信號來確定被測堿基，并給出質量評分。按照圖像上的位置坐標，計算機程序將同一位置測得的堿基根據(jù)測序順序連成讀段〔read〕。由于熒光圖像文件所占有的磁盤空間很大，通常GAIIx平臺一次實驗能就產(chǎn)生上太字節(jié)〔TB〕的圖像文件，所以一般情況下不予保存原始的熒光圖像數(shù)據(jù)，而是只保存程序讀出的讀段數(shù)據(jù)及對應的質量分值，這就是多數(shù)實驗室委托測序中心進行RNA-seq測序后得到的最原始的數(shù)據(jù)。〔3〕RNA-seq數(shù)據(jù)的根本處理①讀段定位：獲得RNA-seq的原始數(shù)據(jù)后，首先需要將所有測序讀段通過序列映射〔mapping〕定位到參考基因組上，這是所有后續(xù)處理和分析的根底。在讀段定位之前，有時還需要根據(jù)測序數(shù)據(jù)情況對其做某些根本的預處理。例如，過濾掉測序質量較差的讀段，對miRNA測序讀段數(shù)據(jù)去除接頭序列等。②基因表達水平估計：RNA測序數(shù)據(jù)是對提取出的RNA轉錄本中隨機進行的短片段測序，如果一個轉錄本的豐度高，那么測序后定位到其對應的基因組區(qū)域的讀段也就多，可以通過對定位到基因外顯子區(qū)的讀段計數(shù)來估計基因表達水平。很顯然，讀段計數(shù)除了與基因真實表達水平成正比，還與基因長度成正比，同時也與測序深度即測序實驗中得到的總讀段數(shù)正相關。造成讀段分布出現(xiàn)偏好的原因可能有多個方面：在制備cDNA文庫時，反轉錄所采用的隨機引物對RNA序列具有一定的偏好性，使得cDNA片段不能夠完全均勻地取自各轉錄本；在PCR擴增中，擴增效率與序列的GC含量等特征相關，可導致GC含量高的cDNA片段在文庫中拷貝數(shù)增加超過其他片段；舍棄多定位的讀段也可能導致讀段的非均勻分布；等等。如果能對讀段分布的不均勻性進行建模并加以校正，可以提高RNA-seq推斷基因表達量的準確度。③選擇性剪接事件識別和剪接異構體表達水平推斷：在真核生物中，選擇性剪接現(xiàn)象普遍存在。基因轉錄形成的mRNA前體〔pre-mRNA〕在剪接過程中因去掉不同的內(nèi)含子區(qū)域或保存不同的外顯子區(qū)域，可形成不同的剪接異構體。根據(jù)RNA-seq原理，只要測序深度足夠深，就能檢測到所有轉錄本的全部序列，包括來自剪接接合區(qū)的序列。利用考慮到接合區(qū)的讀段定位方法，就有可能系統(tǒng)地研究某一組織或某一條件下的基因選擇性剪接事件。④新基因的檢測：在對RNA-seq數(shù)據(jù)的分析中，人們發(fā)現(xiàn)往往不是所有讀段都能定位到已有注釋的基因區(qū)，說明除了轉錄噪聲或測序錯誤等的影響外，可能還存在尚未被注釋的基因。這里，我們把這種尚未注釋的基因稱為新基因，包括新的蛋白質編碼基因和非編碼RNA基因。能檢測新基因，尤其是低表達基因是RNA-seq技術優(yōu)于基因芯片的特點之一，因為它不需要利用基因注釋來設計檢測探針。⑤讀段的可視化及注釋5、非編碼RNA注釋的步驟？P106、RNA-seq技術同基因芯片技術的比較7、RNA-seq的優(yōu)勢8、RNA-seq的挑戰(zhàn)9、RNA-seq的應用P21三、rad9功能研究1、RNA-seq數(shù)據(jù)的注釋2、基因表達譜的分析3、內(nèi)含子區(qū)域表達的分析4、基因間區(qū)域表達的分析5、基因可變剪切的分析6、反義轉錄本的分析7、差異表達基因的分析附：Illumina測序原理Illumina測序技術應用獨特工藝生成高密度、海量平行測序反響，可對每個流動槽中成百至上千萬的模板進行單端或對讀溫暖序。全自動的Illumina

DNA簇，每個簇含有單個模板分子的500－1000克隆拷貝。通過儀器在流動槽外表對生成的高密度序列模板進行測序。采用專有的熒光標記的可逆終止子核苷酸，可對樣本邊合成邊測序。對讀測序時，完成首次讀取后，DNA簇進行原位改進，再生成對讀所用模板。然后應用第二個測序引物對同一DNA簇測序，生成第二次數(shù)據(jù)為什么要研究表觀遺傳學?答：表觀遺傳學主要通過DNA的甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑和非編碼RNA調(diào)控等方式控制基因表達。表觀遺傳學是近幾年興起的而且開展迅速的一個研究遺傳的分支學科，其研究和應用不僅對基因表達、調(diào)控、遺傳有重要作用，而且在腫瘤、免疫等許多疾病的發(fā)生和防治以及干細胞定向分化研究、基因芯片中亦具有十分重要的意義。表觀遺傳學補充了“中心法那么〞忽略的兩個問題，即哪些因素決定了基因的正常轉錄和翻譯以及核酸并不是存儲遺傳信息的唯一載體；在分子水平上，表觀遺傳學解釋了DNA序列所不能解釋的諸多奇怪的現(xiàn)象。如:同一等位基因可因親源性別不同而產(chǎn)生不同的基因印記疾病，疾病嚴重程度也可因親源性別而異。表觀遺傳學信息還可直接與藥物、飲食、生活習慣和環(huán)境因素等聯(lián)系起來，營養(yǎng)狀態(tài)能夠通過改變表觀遺傳以導致癌癥發(fā)生，尤其是維生素和必需氨基酸。此外，表觀遺傳學信息的改變，對包括人體在內(nèi)的哺乳動物基因組有廣泛而重要的效應，如轉錄抑制、基因組印記、細胞凋亡、染色體滅活等。DNA甲基化模式的改變，尤其是某些抑癌基因局部甲基化水平的異常增加，在腫瘤的發(fā)生和開展過程中起到了不容無視的作用。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞DNA存在廣泛的低甲基化和局部區(qū)域的高甲基化共存現(xiàn)象，以及總的甲基化能力增高，這3個特征各以不同的機制共同參與甲基化在腫瘤發(fā)生、開展中的作用。如胃癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌等眾多惡性腫瘤都不同程度地存在一個或多個腫瘤抑制基因CpG島甲基化。而表觀遺傳學改變在本質上的可逆性，又為腫瘤的防治提供了新的策略。所以，隨著表觀遺傳學研究的深入，肯定會對人類生長發(fā)育、腫瘤發(fā)生以及遺傳病的發(fā)病機制及其防治做出新的奉獻，也必將在其他領域中展示其不可估量的作用和廣闊的前景。〔2〕表觀遺傳學涉及到哪些方面？答：表觀遺傳學的研究內(nèi)容主要包括：DNA甲基化、組蛋白的末端修飾和變異體、DNAaseⅠ高敏感位點、非編碼RNA、轉錄因子及其輔助因子、順式調(diào)控元件和基因組印記等?！?〕什么因素會影響基因表達水平？答：基因選擇性轉錄表達的調(diào)控(DNA甲基化,基因印記,組蛋白共價修飾,染色質重塑)基因轉錄后的調(diào)控(基因組中非編碼RNA,微小RNA〔miRNA〕,反義RNA、內(nèi)含子、核糖開關等)1.轉錄水平的調(diào)控：包括DNA轉錄成RNA時的是否轉錄及轉錄頻率的調(diào)控，DNA的序列決定了DNA的空間構型，DNA的空間構型決定了轉錄因子是否可以順利的結合到DNA的調(diào)控序列上，比方結合到TATA等序列上。2.翻譯水平的調(diào)控：翻譯水平的調(diào)控又可以分成翻譯前的調(diào)控和翻譯后的調(diào)控。a、翻譯前的調(diào)控主要是RNA編輯修飾。b、翻譯后調(diào)控主要是蛋白的修飾，蛋白修飾后可以成為有功能的蛋白或者有隱藏功能的蛋白。在真核和原核細胞中，從基因表到達蛋白質合成，其間有許多地方受到調(diào)控，這些調(diào)控點主要可以分成兩個局部：轉錄調(diào)控(transcriptioncontrol)和轉錄后調(diào)控(posttranscriptioncontrol)。轉錄調(diào)控是指以DNA為模板合成RNA的調(diào)控，所有的細胞都具有大量序列特異的DNA結合蛋白，這些蛋白能準確地識別并結合到特異的DNA序列，在轉錄水平上起著開關的作用。轉錄后調(diào)控是指在RNA轉錄后對基因表達的調(diào)控，轉錄后調(diào)控主要包括：①RNA加工調(diào)控，它僅在真核細胞中發(fā)生，由它控制初級轉錄物如何及何時進行剪接形成可用的mRNA，例如，在不同類型的細胞中從同一基因產(chǎn)生的轉錄物可以通過選擇內(nèi)含子來產(chǎn)生不同的mRNA；②翻譯調(diào)控，通過翻譯調(diào)控確立哪些mRNA翻譯成蛋白質及什么時候翻譯，例如通過特異的mRNA結合蛋白可以抑制翻譯，或者通過位于mRNA末端的特異核苷酸序列加速核糖體的結合，從而促進翻譯；③mRNA降解調(diào)控，這可影響到某些mRNA種類的穩(wěn)定性；④蛋白質活性調(diào)控，可選擇性地使某些特異的蛋白分子激活、失活、修改、或區(qū)域化，從而影響到蛋白質怎樣或何時起作用，例如，某些蛋白質只在某個特殊的發(fā)育階段的某些細胞中起作用，而這些蛋白質對其它的細胞有很大的影響，因而在這些細胞中必須將其失活或激活后立即將其定位到特殊的細胞結構中，否那么就會引起不正常的發(fā)育?！?〕有哪些研究方法？它們各有什么特點？meDNAanalysisDNaseImappingMNasemappingAlternativeSplicing&Non-codingRNA染色質免疫共沉淀技術〔ChIP〕真核生物的基因組DNA以染色質的形式存在。因此，研究蛋白質與DNA在染色質環(huán)境下的相互作用是說明真核生物基因表達機制的根本途徑。染色質免疫沉淀技術〔chromatinimmunoprecipitationassay,CHIP〕是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質相互作用的方法。它的根本原理是在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質－DNA復合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質小片段，然后通過免疫學方法沉淀此復合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。CHIP不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。而且，CHIP與其他方法的結合，擴大了其應用范圍：CHIP與基因芯片相結合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內(nèi)足跡法相結合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結合位點；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表達調(diào)控中的作用。由此可見，隨著CHIP的進一步完善，它必將會在基因表達調(diào)控研究中發(fā)揮越來越重要的作用染色體構象捕捉技術〔3C〕，首先將標本用甲醛處理，使染色體交互的局部緊密的連接在一起，然后用特殊的方法是交聯(lián)的兩段序列形成環(huán)狀，最后用定量PCR或者芯片檢測某兩段序列發(fā)生交聯(lián)的頻率。甲基化特異性PCR(MSP)原理:MSP是一種簡單、特異、敏感的檢測單基因甲基化的方式。其根本原理是用亞硫酸氫鈉處理基因組DNA，未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，然后用3對特異性引物對所測基因的同一核苷酸序列進行擴增。擴增產(chǎn)物用DNA瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描觀察分析結果。凝膠遷移或電泳遷移率實驗〔EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay〕是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技術最初用于研究DNA結合蛋白，目前已用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，別離復合物和非結合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當檢測如轉錄調(diào)控因子一類的DNA結合蛋白，可用純化蛋白，局部純化蛋白，或核細胞抽提液。在檢測RNA結合蛋白時，依據(jù)目的RNA結合蛋白的位置，可用純化或局部純化的蛋白，也可用核或胞質細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段〔特異〕，和其它非相關的片段〔非特異〕，來確定DNA或RNA結合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復合物的特點和強度來確定特異結合。熒光原位雜交(FISH)：,以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法,探針首先與某種介導分子(reportermolecule)結合,雜交后再通過免疫細胞化學過程連接上熒光染料.FISH的根本原理是將DNA(或RNA)探針用特殊的核苷酸分子標記,然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上,再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析.FISH具有平安、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時顯示多種顏色等優(yōu)點,不但能顯示中期分裂相,還能顯示于間期核.同時在熒光原位雜交根底上又開展了多彩色熒光原位雜交技術和染色質纖維熒光原位雜交技術.肖景發(fā)：簡述藥物基因組學的定義以及生物信息學在藥物發(fā)現(xiàn)過程中的主要應用。答：藥物基因學〔1〕：是研究遺傳因素對藥物效應的影響,確定藥物作用的靶點,即從表型至基因型的藥物反響的個體多樣性的研究。它將基因的多態(tài)性與藥物效應個體多樣性緊密聯(lián)系在一起。通過它的研究,將更科學地評價各種藥物的療效和毒性,同時也對不同患者根據(jù)DNA多態(tài)性的差異選擇高效和低毒的藥物加以治療。藥物基因學〔2〕：綜合藥理學和遺傳學、研究個體基因遺傳因素如何影響機體對藥物反響的交叉學科。主要研究基因結構多態(tài)性與不同藥物反響之間關系，解釋由于個體之間差異所表現(xiàn)出藥物的不同治療效果，趨向于用藥個性化。用藥個性化將產(chǎn)生最大的效果和平安性。生物信息學在藥物發(fā)現(xiàn)過程中的主要應用：答：主要表達在以下幾個方面：靶點確實定；生物信息學可以幫助人們在藥物開發(fā)過程中更早、更快地找到更佳的藥物作用靶點減少研發(fā)時間和所需臨床試驗的數(shù)量〔如抗生素類藥物理想的作用靶點應具有為病原體所特有、在病原體中高度保守在人體中不存在等特點〕生物信息學技術就可以通過將病原體基因或基因序列與人類基因及其基因序列進行比較分析篩選出該類藥物理想的作用靶點。靶點的選擇；通過生物信息學的幫助能更好地在靶點發(fā)現(xiàn)的早期階段進行位點的篩選和確定。除此之外它還在以下三個方面有助于對靶點的選擇：對靶點的定性如蛋白質家族的分類和亞類；對靶點的功能等特性的理解如靶點在更大的生化或細胞環(huán)境中的生物學行為；對靶點的利用及其對有關內(nèi)容的研究〔如預測針對靶點的藥物在病人體內(nèi)的攝取或重復攝取解毒及其以此基因為根底的變異〕；表達序列標簽；表達序列標簽來自隨機選取的克隆的末端序列，簡單地說，一個EST就是對應于某一種mRNA的一個cDNA克隆的一段序列,一般長度大于15Ob的EST在同源查找和基因作圖中的作用較大。基因組序列；生物信息學在作圖和序列數(shù)據(jù)處理方面為破譯人類基因組的全部10萬個左右基因提供了主要的支持?；蚨鄳B(tài)性；作為基因組的標志之一SNPs與疾病和藥效的變化有很大關系。在人類基因組中估計有300到1000萬個SNPs。對于如此巨大的數(shù)目的SNP只有將生物信息學手段和計算機自動識別方法相結合并充分利用DNA信息數(shù)據(jù)庫才能簡便有效價廉地開掘出具有應用價值的SNPs。6.基因表達；基因表達的組織定位是靶點確立中十分重要的一個方面。基因組研究的啟動提供了大量的可作為研究目標的藥物潛在作用靶點,而了解基因在何時何處表達對認識基因的功能將有十分重要的意義。生物信息學對這個問題的首要奉獻就是能對源于不同文庫的ESTs進行計數(shù),這有利于發(fā)現(xiàn)那些只限于在某些特定的組織中大量表達的基因。綜上所述,生物信息學在基因研究和藥物開發(fā)中發(fā)揮著越來越重要的作用。而生物信息學面臨的挑戰(zhàn)是建立更大規(guī)模的能夠綜合多來源知識和信息、包含多種不同的混雜數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，以便將生物學、化學、臨床等不同領域的數(shù)據(jù)資料聯(lián)系在一起并建立通用的智能型工具。目前生物信息學在融合不同的數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)圖表和數(shù)據(jù)模型等方面所遇到的困難也反映了藥物開發(fā)本身在融合所涉及領域的各種信息和觀點方面所面臨的潛在的挑戰(zhàn)?！惭a充〕藥物基因組學在個體化給藥中的應用及意義藥物基因組學從基因水平給出了遺傳因素(基因變異)與藥物效應之間的關系,基因的變異與藥物效應的差異具有相關性。患者對某些藥物的反響率與其基因亞型之間關系現(xiàn)已揭示,雖然藥物基因組學并不能改善藥物的效應,但這種關系能輔助臨床人員在預測某一特定藥物時,患者屬何種反響人群,使醫(yī)生為患者選擇療效最正確的藥物和確定最正確劑量成為可能。通過對病人的基因檢測,再開出“基因適宜〞的藥方即“基因處方〞。這種最恰當?shù)乃幏?可使病人得到最正確的治療效果，從而到達真正“用藥個體化〞的目的。目前,已有將藥物基因組學知識應用于高血壓、哮喘、高血脂、內(nèi)分泌、腫瘤等藥物治療中的成功病例。藥物基因組學應用到臨床合理用藥中,彌補了只根據(jù)血藥濃度進行個體化給藥的缺乏,為以前無法解釋的藥效學現(xiàn)象找到了答案,為臨床個體化給藥開辟了一個新的途徑。簡述動態(tài)規(guī)劃算法及應用答：動態(tài)規(guī)劃是一種算法設計方法，它通過組合子問題的解而解決整個問題，但它防止了相同問題的重復計算，動態(tài)規(guī)劃通常應用于最優(yōu)化問題，能用動態(tài)規(guī)劃算法求解的問題通常有兩個很鮮明的特征：最優(yōu)子結構和子問題重疊；所謂的最優(yōu)子結構問題是指原問題的最優(yōu)解包含了其子問題的最優(yōu)解。問題的最優(yōu)子結構性質提供了該問題可用動態(tài)規(guī)劃算法求解的重要線索。運用動態(tài)規(guī)劃算法的最大難點在于子問題的分解，也即是遞推式的獲得，一旦得到了該問題的遞推式，問題就相當于已經(jīng)解決了，因為根據(jù)遞推式來寫程序實現(xiàn)是一件很容易的事情。動態(tài)規(guī)劃算法的設計通常分為如下步驟：1.將問題分解成一些規(guī)模更小的子問題，根據(jù)子問題與原問題的關系描述最優(yōu)解的結構2.根據(jù)該關系遞歸定義最優(yōu)解的值，并運用反證法證明該方案的正確性。3.按自底向上的方式計算最優(yōu)解的值，在計算過程中，保存已解決的子問題的答案。每個子問題只計算一次，而在后面需要的時候只要簡單查一下，從而防止大量的重復計算，最終得到多項式時間的算法4.由計算出的結果構造一個最優(yōu)解典型應用：a．序列比對，包括DNA和蛋白質序列的比對，全局優(yōu)化比對算法Needleman-Wunsch算法和局部比對算法Smith-Waterman算法等均是基于此方法。b．RNA二級結構的預測，此算法的依據(jù)是使一段RNA序列形成的A-U，G-C配對數(shù)最大。c．最長公共子序列。microRNA的基因組學研究技術與應用microRNA〔miRNA)是一類廣泛存在于生物體中的非編碼、小分子、單鏈RNA，大約含有18-25nt，能夠結合在靶基因3’UTR區(qū)，通過降解mRNA、影響mRNA的穩(wěn)定性或抑制蛋白合成，在轉錄后水平上調(diào)控靶基因的表達.miRNA的作用機制1.miRNA翻譯起始抑制機制目前主要有3種觀點：miRNA可能通過抑制全能性核糖體的組裝而阻斷翻譯起始。miRNA抑制要求靶mRNAm7G帽子的存在,認為miRISC可能抑制翻譯起始復合物的形成miRNA還可能通過阻止polyA結合蛋白polyAbindingprotein(PABP),與mRNA結合影響翻譯起始.2.miRNA翻譯起始后抑制?miRNA可能引起新生多肽鏈的翻譯同步降解。?在翻譯延伸過程中,miRNA引發(fā)大量的核糖體脫落及高頻次的翻譯提前終止。3.miRNA介導mRNA降解–Ago蛋白定位于細胞中降解mRNA的RNA顆粒(RNAgranules),如P小體(processingbodies)中,這些RNA顆粒中包含常規(guī)的mRNA降解酶,如脫腺嘌呤酶、脫帽酶、核酸外切酶等,提示這些mRNA降解酶可能參與miRNA介導的mRNA的降解.4.RNA顆粒扣押、降解或儲存靶mRNA??胞漿的RNA顆粒,如P小體和SG(StressGranules)顆粒,在轉錄后水平的基因表達調(diào)控中具有重要的作用,它們是細胞儲存處于翻譯抑制狀態(tài)mRNA的場所。5.miRNA正調(diào)控和去抑制?在靜態(tài)細胞中(G0期),miRNA活化翻譯和上調(diào)基因表達,而在其他細胞循環(huán)/增殖期那么繼續(xù)發(fā)揮抑制作用。?在一些條件下,miR-10a也正調(diào)控基因表達。–結合在5’UTR。?miRNA的抑制作用是可逆的。?mRNA逃避抑制。–3’UTR保守性縮短MiRNA在腫瘤治療中的作用–miRNA相關的腫瘤發(fā)生通常是由于某些特定的miRNA低表達或者不表達，或者某些特定的miRNA高表達。?MiRNA在抗病毒治療中的應用潛力–miRNA與靶mRNA序列不完全互補時也可通過抑制蛋白翻譯起到基因沉默的作用，所以當病毒出現(xiàn)變異時也可以干擾病毒的復制。MiRNA在抗病毒治療中的應用潛力–miRNA與靶mRNA序列不完全互補時也可通過抑制蛋白翻譯起到基因沉默的作用，所以當病毒出現(xiàn)變異時也可以干擾病毒的復制。為什么要研究表觀遺傳學?答：表觀遺傳學主要通過DNA的甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑和非編碼RNA調(diào)控等方式控制基因表達。表觀遺傳學是近幾年興起的而且開展迅速的一個研究遺傳的分支學科，其研究和應用不僅對基因表達、調(diào)控、遺傳有重要作用，而且在腫瘤、免疫等許多疾病的發(fā)生和防治以及干細胞定向分化研究、基因芯片中亦具有十分重要的意義。表觀遺傳學補充了“中心法那么〞忽略的兩個問題，即哪些因素決定了基因的正常轉錄和翻譯以及核酸并不是存儲遺傳信息的唯一載體；在分子水平上，表觀遺傳學解釋了DNA序列所不能解釋的諸多奇怪的現(xiàn)象。如:同一等位基因可因親源性別不同而產(chǎn)生不同的基因印記疾病，疾病嚴重程度也可因親源性別而異。表觀遺傳學信息還可直接與藥物、飲食、生活習慣和環(huán)境因素等聯(lián)系起來，營養(yǎng)狀態(tài)能夠通過改變表觀遺傳以導致癌癥發(fā)生，尤其是維生素和必需氨基酸。此外，表觀遺傳學信息的改變，對包括人體在內(nèi)的哺乳動物基因組有廣泛而重要的效應，如轉錄抑制、基因組印記、細胞凋亡、染色體滅活等。DNA甲基化模式的改變，尤其是某些抑癌基因局部甲基化水平的異常增加，在腫瘤的發(fā)生和開展過程中起到了不容無視的作用。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞DNA存在廣泛的低甲基化和局部區(qū)域的高甲基化共存現(xiàn)象，以及總的甲基化能力增高，這3個特征各以不同的機制共同參與甲基化在腫瘤發(fā)生、開展中的作用。如胃癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌等眾多惡性腫瘤都不同程度地存在一個或多個腫瘤抑制基因CpG島甲基化。而表觀遺傳學改變在本質上的可逆性，又為腫瘤的防治提供了新的策略。所以，隨著表觀遺傳學研究的深入，肯定會對人類生長發(fā)育、腫瘤發(fā)生以及遺傳病的發(fā)病機制及其防治做出新的奉獻，也必將在其他領域中展示其不可估量的作用和廣闊的前景?！?〕表觀遺傳學涉及到哪些方面？答：表觀遺傳學的研究內(nèi)容主要包括：DNA甲基化、組蛋白的末端修飾和變異體、DNAaseⅠ高敏感位點、非編碼RNA、轉錄因子及其輔助因子、順式調(diào)控元件和基因組印記等?！?〕什么因素會影響基因表達水平？答：基因選擇性轉錄表達的調(diào)控(DNA甲基化,基因印記,組蛋白共價修飾,染色質重塑)基因轉錄后的調(diào)控(基因組中非編碼RNA,微小RNA〔miRNA〕,反義RNA、內(nèi)含子、核糖開關等)1.轉錄水平的調(diào)控：包括DNA轉錄成RNA時的是否轉錄及轉錄頻率的調(diào)控，DNA的序列決定了DNA的空間構型，DNA的空間構型決定了轉錄因子是否可以順利的結合到DNA的調(diào)控序列上，比方結合到TATA等序列上。2.翻譯水平的調(diào)控：翻譯水平的調(diào)控又可以分成翻譯前的調(diào)控和翻譯后的調(diào)控。a、翻譯前的調(diào)控主要是RNA編輯修飾。b、翻譯后調(diào)控主要是蛋白的修飾，蛋白修飾后可以成為有功能的蛋白或者有隱藏功能的蛋白。在真核和原核細胞中，從基因表到達蛋白質合成，其間有許多地方受到調(diào)控，這些調(diào)控點主要可以分成兩個局部：轉錄調(diào)控(transcriptioncontrol)和轉錄后調(diào)控(posttranscriptioncontrol)。轉錄調(diào)控是指以DNA為模板合成RNA的調(diào)控，所有的細胞都具有大量序列特異的DNA結合蛋白，這些蛋白能準確地識別并結合到特異的DNA序列，在轉錄水平上起著開關的作用。轉錄后調(diào)控是指在RNA轉錄后對基因表達的調(diào)控，轉錄后調(diào)控主要包括：①RNA加工調(diào)控，它僅在真核細胞中發(fā)生，由它控制初級轉錄物如何及何時進行剪接形成可用的mRNA，例如，在不同類型的細胞中從同一基因產(chǎn)生的轉錄物可以通過選擇內(nèi)含子來產(chǎn)生不同的mRNA；②翻譯調(diào)控，通過翻譯調(diào)控確立哪些mRNA翻譯成蛋白質及什么時候翻譯，例如通過特異的mRNA結合蛋白可以抑制翻譯，或者通過位于mRNA末端的特異核苷酸序列加速核糖體的結合，從而促進翻譯；③mRNA降解調(diào)控，這可影響到某些mRNA種類的穩(wěn)定性；④蛋白質活性調(diào)控，可選擇性地使某些特異的蛋白分子激活、失活、修改、或區(qū)域化，從而影響到蛋白質怎樣或何時起作用，例如，某些蛋白質只在某個特殊的發(fā)育階段的某些細胞中起作用，而這些蛋白質對其它的細胞有很大的影響，因而在這些細胞中必須將其失活或激活后立即將其定位到特殊的細胞結構中，否那么就會引起不正常的發(fā)育。〔4〕有哪些研究方法？它們各有什么特點？meDNAanalysisDNaseImappingMNasemappingAlternativeSplicing&Non-codingRNA染色質免疫共沉淀技術〔ChIP〕真核生物的基因組DNA以染色質的形式存在。因此，研究蛋白質與DNA在染色質環(huán)境下的相互作用是說明真核生物基因表達機制的根本途徑。染色質免疫沉淀技術〔chromatinimmunoprecipitationassay,CHIP〕是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質相互作用的方法。它的根本原理是在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質－DNA復合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質小片段，然后通過免疫學方法沉淀此復合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。CHIP不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。而且，CHIP與其他方法的結合，擴大了其應用范圍：CHIP與基因芯片相結合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內(nèi)足跡法相結合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結合位點；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表達調(diào)控中的作用。由此可見，隨著CHIP的進一步完善，它必將會在基因表達調(diào)控研究中發(fā)揮越來越重要的作用染色體構象捕捉技術〔3C〕，首先將標本用甲醛處理，使染色體交互的局部緊密的連接在一起，然后用特殊的方法是交聯(lián)的兩段序列形成環(huán)狀，最后用定量PCR或者芯片檢測某兩段序列發(fā)生交聯(lián)的頻率。甲基化特異性PCR(MSP)原理:MSP是一種簡單、特異、敏感的檢測單基因甲基化的方式。其根本原理是用亞硫酸氫鈉處理基因組DNA，未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，然后用3對特異性引物對所測基因的同一核苷酸序列進行擴增。擴增產(chǎn)物用DNA瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描觀察分析結果。凝膠遷移或電泳遷移率實驗〔EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay〕是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技術最初用于研究DNA結合蛋白，目前已用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，別離復合物和非結合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當檢測如轉錄調(diào)控因子一類的DNA結合蛋白，可用純化蛋白，局部純化蛋白，或核細胞抽提液。在檢測RNA結合蛋白時，依據(jù)目的RNA結合蛋白的位置，可用純化或局部純化的蛋白，也可用核或胞質細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段〔特異〕，和其它非相關的片段〔非特異〕，來確定DNA或RNA結合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復合物的特點和強度來確定特異結合。熒光原位雜交(FISH)：,以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法,探針首先與某種介導分子(reportermolecule)結合,雜交后再通過免疫細胞化學過程連接上熒光染料.FISH的根本原理是將DNA(或RNA)探針用特殊的核苷酸分子標記,然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上,再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析.FISH具有平安、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時顯示多種顏色等優(yōu)點,不但能顯示中期分裂相,還能顯示于間期核.同時在熒光原位雜交根底上又開展了多彩色熒光原位雜交技術和染色質纖維熒光原位雜交技術.肖景發(fā)：簡述藥物基因組學的定義以及生物信息學在藥物發(fā)現(xiàn)過程中的主要應用。答：藥物基因學〔1〕：是研究遺傳因素對藥物效應的影響,確定藥物作用的靶點,即從表型至基因型的藥物反響的個體多樣性的研究。它將基因的多態(tài)性與藥物效應個體多樣性緊密聯(lián)系在一起。通過它的研究,將更科學地評價各種藥物的療效和毒性,同時也對不同患者根據(jù)DNA多態(tài)性的差異選擇高效和低毒的藥物加以治療。藥物基因學〔2〕：綜合藥理學和遺傳學、研究個體基因遺傳因素如何影響機體對藥物反響的交叉學科。主要研究基因結構多態(tài)性與不同藥物反響之間關系，解釋由于個體之間差異所表現(xiàn)出藥物的不同治療效果，趨向于用藥個性化。用藥個性化將產(chǎn)生最大的效果和平安性。生物信息學在藥物發(fā)現(xiàn)過程中的主要應用