大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

實驗原理

在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi)，但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的基因，因此不能自行完成從一個細(xì)胞到另一個細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。經(jīng)一定的理化方法誘導(dǎo)后，處于適于攝取和容納外源DNA的細(xì)胞，稱為感受態(tài)細(xì)胞。目前，制備感受態(tài)細(xì)胞已成為基因操作的常規(guī)技術(shù)。感受態(tài)細(xì)胞:原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。特點：細(xì)胞的通透性在制備過程中增強使其易于接受外源基因。細(xì)胞本身應(yīng)為修飾、限制酶缺陷的菌株，使外源DNA分子不易被切除或破壞。制備感受態(tài)細(xì)胞可以使用電擊法或化學(xué)法。電擊法是利用瞬時高壓電流處理細(xì)胞懸浮液，使細(xì)胞膜發(fā)生去極化，產(chǎn)生微孔，懸液中的核酸就可通過微孔進(jìn)入細(xì)胞。電擊轉(zhuǎn)化需要儀器幫助化學(xué)法則更加簡便，尤其適用于原核細(xì)胞感受態(tài)制備。大腸桿菌感受態(tài)制備：RuCl法CaCl2法

其原理是細(xì)胞在低溫，低滲CaCl2（）作用下，會發(fā)生膨脹，Ca2+使細(xì)胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，誘導(dǎo)細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化時混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，通過熱刺激，液晶態(tài)細(xì)胞膜表面產(chǎn)生裂隙，使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。操作步驟細(xì)菌接種與培養(yǎng)

取-70℃冰凍大腸桿菌DH5α菌種，用劃線法接種細(xì)菌于培養(yǎng)皿，做好標(biāo)記，于37℃培養(yǎng)過夜。第二天，從平板上挑取單個菌落，接種至含有3mlLB培養(yǎng)液的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日取菌液30μL接種至含有3mlLB培養(yǎng)基的試管中，37℃劇烈震蕩培養(yǎng)約2~3小時（200~300r/min）。菌體收集

當(dāng)菌落600nmOD值達(dá)到時，將試管取出放置冰上10~15分鐘。在無菌條件下，取1ml菌液裝入離心管中。4℃,5000rpm離心5min。棄上清，將管倒置于干濾紙上1min，吸干殘留的培養(yǎng)液。制備感受態(tài) (1)加200μL

冰預(yù)冷的0.1MCaCl2到離心管中，振蕩混勻，使菌體懸浮，冰浴30min。 (2)4℃,5000rpm離心5分鐘，棄上清，將管倒置于干濾紙上，吸干殘留液體。 (3)加50μL冰預(yù)冷的的CaCl2，重懸浮菌體，放至4℃保存?zhèn)溆茫?4~48小時內(nèi)使用效果較好。如果暫時不用，可加入等體積的30%的甘油（甘油終濃度為15%），混勻。液氮速凍后保存于-80℃低溫冰箱中待用，可保存半年以上。注意事項

細(xì)胞的生長狀態(tài)和密度

最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。不要用已多次轉(zhuǎn)接，或貯存在4℃的培養(yǎng)菌液。應(yīng)用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細(xì)菌，可通過測定培養(yǎng)液OD600控制。DH5α菌株的OD600

為時，細(xì)胞密度在5×107

個/ml左右，過高或不足均會使轉(zhuǎn)化率下降。注意事項防止污染

整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等需要經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要