分光光度法實驗教學的思考

分光光度法實驗教學的思考

生物學是一門以實驗為基礎的學科。實驗教學是生物學教學的重要內容和環(huán)節(jié)。隨著科學技術的發(fā)展,生物學研究也從定性研究向定量研究過渡。在眾多定量測定分析技術中,分光光度法的應用最為普遍。因此,作為教學儀器,紫外/可見分光光度計也從大學課堂走向中學課堂。如何更好地使用分光光度計,有效提高教學效果,培養(yǎng)學生的創(chuàng)新思維和動手能力,是教師必須面對的問題之一。1檢測系統(tǒng)組成在有關分光光度法的教學實驗中,教學環(huán)節(jié)從介紹分光光度計原理入手,能起到舉一反三的效果。但應注意的是在教學中不應過多介紹Beer-Lambert光吸收定律及推導公式,重點在于分光光度計的組成和應用。尤其是對物理、化學基礎較差的學生,過多的公式推導容易讓學生產生深奧感而排斥學習。各種型號的紫外/可見光分光光度計,不論何種形式,基本上都由五部分組成:光源、單色器、樣品、接受檢測放大系統(tǒng)、顯示或記錄器。前三部分構成光學系統(tǒng),后兩部分構成電學系統(tǒng)。兩個系統(tǒng)的組合把物質的光吸收變化轉變成電流變化,從而定量分析物質的含量。(1)光源分為可見光源和紫外光源。前者常用鎢燈,適用波長范圍是400~760nm;后者常用氘燈,適用波長范圍是195~400nm。(2)單色器是分光光度計的心臟部分,它的作用是把來自光源的混合光分解為單色光,并能通過調節(jié)波長選擇所需入射光路中單色光的波長。單色器中核心元件——色散元件也已從棱鏡向光柵等更精密的元件過渡。波長的選擇和單色光質量是分光光度法測量精確度的關鍵。(3)樣品室是放置待測樣品的位置。待測樣品一般盛在吸收池內(即比色杯)。比色杯有普通光學玻璃和石英玻璃杯兩種。前者由于吸收紫外光,只能用于可見光波長測定,適用波長范圍是400~2000nm。后者可透過紫外光、可見光和紅外光,適用波長范圍是180~3000nm。(4)接受檢測放大系統(tǒng)是接收透過比色杯的光強,并以電信號顯示出來,主要元件是光電轉換設備。常用的檢測器已從最初的光電管、光電信增管、光電二極管等轉換為電荷耦合器件(CCD)等,從而有更強的光電轉換效果。(5)顯示裝置是將光吸收值顯示出來,早期是以電流表顯示,現(xiàn)已逐漸用數(shù)顯或計算機等所替代,從而減少讀數(shù)誤差。2測定樣品時注意使用比色杯在了解基本原理的基礎上,分光光度計的使用主要從以下幾個方面著手:(1)光源和波長的選擇根據(jù)所測定的物質的性質,選擇合適的光源和波長。一般在可見光范圍選擇鎢燈,紫外選擇氫燈,但現(xiàn)在也有的紫外/可見分光光度計在設計上已取消光源選擇,只要一打開機器,兩種光源都打開。初學者常犯的錯誤是忽視波長的選擇,教學中常遇到的事情是學生把樣品測完了才發(fā)現(xiàn)波長選錯了,究其原因是沒有檢查波長設置。因此,在教學中,我們經常強調使用分光光度計時,第一步是打開電源,第二步就是檢查波長。如果是繼續(xù)別人后使用儀器,則第一步就是檢查波長。(2)樣品測定用于分光光度計測定樣品物質含量的基本原理是,樣品在一定波長下光吸收值的大小與樣品中該物質濃度成正比。而最好的線性關系是在光吸收值為0.3~0.7時。因此,測定前要經過預實驗確定合適的樣品濃度,讓反應后的待測溶液的光吸收值位于這個范圍內。否則,待測數(shù)據(jù)不能正確反映實際變化。學生常有的一個誤區(qū)是光吸收超過1.0以上時,將待測液稀釋后測定。實驗數(shù)據(jù)表明,這種做法是不正確的,樣品稀釋應該在反應前而不應在反應后。如果不同樣品之間濃度差異較大,則在測定時應先測定低濃度(淺色),再定測高濃度(深色),這樣可以避免反復洗比色杯。不僅節(jié)省時間,還可以避免洗杯后潤洗所造成的誤差。為了減少比色杯的光吸收誤差,除了測定前校正比色杯外,可以在測定中平行樣品間使用同一個比色杯測定。當分光光度計使用時,每次測定樣品時應先用對照校正零點(機器和光吸收),然后再將待測樣品拉入光路進行測定。實際操作時也可以只校正光吸收零點,當光吸收零點出現(xiàn)較大誤差時,再全部校正。因為分光光度法是以物質光吸收作為設計基礎的,一般測定時常以蒸餾水等作為參照調正儀器的零點和光吸收的零點。測定樣品得到的光吸收值減去空白管光吸收值,再去計算含量。但實際上,比較以空白管代替蒸餾水管來調儀器的零點和光吸收零點,所測得的光吸收值和一般操作所測定的光吸收值是一樣的。但這樣做的結果不僅簡便了實驗操作,而且消除了試劑本身的光吸收值。(3)比色杯的使用如前所述,測定范圍在可見光時選用普通玻璃比色杯,石英比色杯則在紫外/可見光范圍使用,由于石英比色杯價格較貴,所以測可見光時盡量選用普通玻璃比色杯。拿比色杯時手指不能觸摸透光面,放入樣品室時應讓光路穿過透光面,比色杯內的樣品液應達到比色杯體積的2/3高度,過高容易溢出損壞樣品室,過低不能覆蓋光路,影響測量數(shù)據(jù)精確性。傾倒測定后樣品時,應先將樣品倒回試管,并繼續(xù)保持比色杯口朝下狀態(tài),然后將比色杯口扣到粗濾紙上,移動2~3次,至濾紙上沒有液體痕跡為止。這樣可以將殘留液體吸到粗濾紙上,當再次盛下個待測樣品時,一方面杯子內無殘留液;另一方面杯子外也不會有液體殘留。既避免了擦拭杯子,又節(jié)省了測定時間和擦鏡紙。倒回試管的樣品,在測定結束后確認數(shù)據(jù)無誤時,再倒掉,這樣可以避免發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)有誤時,樣品已倒掉的尷尬。擦拭比色杯時應用擦鏡紙或綢布擦,不可用硬紙或布擦拭透光面。用擦鏡紙擦拭時,可將大張紙剪成小張,每次用指肚頂著擦鏡紙,輕輕單向擦拭杯子。然后,再換紙的另一點再單向擦,不能來回擦,也不能用一點反復擦,簡潔表達為“單點單面”,即擦鏡紙的每一點只能用一次,可以折疊也可以換面(生活中擦眼鏡也應是同樣道理和方法)。學生在實驗中往往記住了“單向”,忽略了“單點”,為了加深印象,教師應給學生做示范如何擦拭比色杯。比色杯用后應及時清洗,一般先用自