柱前衍生化法測定藏羚羊糞便中生殖激素的含量

柱前衍生化法測定藏羚羊糞便中生殖激素的含量

隸屬于偶蹄目?？坪鸵莆鞑伛橊劇＿@是青藏高原的特有品種。被列為國家一級保護動物，是不利的野生生物種子貿(mào)易條約（cites）中的受試動物。藏羚的交配與繁殖呈季節(jié)規(guī)律性,交配發(fā)生在12月中下旬,繁殖季節(jié)為6～8月。引起動物繁殖行為周期性規(guī)律變化的最直接內(nèi)分泌因子是生殖腺分泌的性激素,因此要了解動物周期性繁殖的生理機制,首先要研究其繁殖行為的性激素調(diào)節(jié)過程。血漿中激素含量可以反映動物個體的生理狀態(tài),然而由于該研究中藏羚血樣的采集非常困難,而且藏羚的應(yīng)激性特別強,勢必會造成血漿中激素濃度的波動,因此采用非損傷采樣方法,在動物不受人為干擾的情況下取其糞便測定動物的激素水平。值得慶幸的是,已有研究表明性激素在血漿和糞樣中的濃度有很高的相關(guān)性,Wasser和Lasley等認為這種方法在許多研究尤其是野生動物的生理生態(tài)研究中具有很大的應(yīng)用潛力。筆者以皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、睪酮、孕酮分析對象,這4種激素是一類小分子脂溶性化合物,對動物體內(nèi)調(diào)節(jié)代謝、促進生殖器官的發(fā)育成熟、調(diào)節(jié)生殖機能以及對動物脅迫作用具有調(diào)節(jié)功能。以往對類固醇的分析多采用放射性免疫法(IAs),但該方法不能實現(xiàn)多種類固醇的同時測定。盡管方法能提供較高的靈敏度,但由于抗體的可交叉反應(yīng),被分析的基質(zhì)中存在的雌激素酮、雌激素硫酸鹽和其他一些雌激素嚴(yán)重干擾類固醇激素的測定,檢測選擇性差。采用在線的UV-LC測定已有報道,但是相對低的靈敏度難以獲得滿意結(jié)果。筆者采用自制的衍生化試劑2-(11H-苯﹝α﹞咔唑)-乙基肼基甲酸酯(BCECH)對皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、睪酮、孕酮進行熒光標(biāo)記,對藏羚糞便中4種類固醇激素含量進行測定。1材料和方法1.1色譜柱及色譜圖1100型高效液相色譜(美國Agilent公司),配備四元梯度泵、在線真空脫氣機、100位自動進樣器、熒光檢測器;HypersilBDSC18色譜柱(4.6mm×200mm,5μm,大連依利特公司)。2-(11H-苯﹝a﹞卡唑)-已基肼基甲酸酯(自制);無水乙腈(禹城化學(xué)試劑廠)用P2O5干燥后蒸餾處理;三氯乙酸為分析純,純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。孕酮、睪酮、皮質(zhì)醇和皮質(zhì)酮的標(biāo)準(zhǔn)品均購自Sigma公司,其結(jié)構(gòu)如圖1所示。1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別稱取4種類固醇標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈配成1.0×10-2mol/L的溶液,相應(yīng)低濃度的混合類固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(1×10-4mol/L)用乙腈稀釋而成。稱取15.95mg的2-(11H-苯﹝a﹞卡唑)-乙基肼基甲酸酯,用無水乙腈定容至10ml,濃度為5×10-3mol/L。1.3糞樣的采集和處理試驗中糞便的供體動物為人工馴養(yǎng)藏羚。馴養(yǎng)藏羚圈養(yǎng)于青海省海北藏族自治州鐵卜加草原改良實驗站的圍欄內(nèi),圍欄內(nèi)無其他家畜,藏羚可在圍欄內(nèi)自由采食。糞樣采自圍欄內(nèi)藏羚的新鮮糞便,于-80℃保存。試驗時常溫解凍,60℃烘干后粉碎成粉末狀,剔除雜質(zhì)、粗纖維和未消化的食物殘渣。準(zhǔn)確稱取0.5g粉末放入5ml俱塞離心管中,依次加入雙蒸水1.5ml、二氯甲烷2.5ml,搖勻。將離心管超聲振蕩30min,然后搖床振蕩2h。6000r/min離心20min,取出二氯甲烷提取液1ml于2ml離心管中,自然揮發(fā)干燥。4℃保存待測。1.4準(zhǔn)液及其他乙腈的合成向安培瓶中依次加入40μl衍生試劑溶液,50μl混合類固醇標(biāo)準(zhǔn)液(或300μl糞便提取液),30μlCl3CCOOH的乙腈溶液,封口后65℃恒溫水浴振蕩反應(yīng)30min。冷卻至室溫,稀釋10倍后進樣分析(進樣量10μl),衍生化反應(yīng)如圖2所示。1.5u3000酸、堿分別進樣、柱、水、水色譜柱:HypersilBDSC18色譜柱(4.6mm×200mm,5μm);流動相A:30%乙腈水溶液(含有20mmol/L的HCOONH4,pH=3.5);B:100%的乙腈。梯度洗脫程序:由90%A經(jīng)35min線性梯度到80%B,經(jīng)2min線性梯度到100%B,保持8min。每次進樣前用流動相A平衡柱子5min。流速為1.0ml/min,柱溫30℃。熒光激發(fā)和發(fā)射波長分別為:λex=275nm,λem=380nm。1.6干燥氣流量電暈法大氣壓化學(xué)電離源(APCI),正離子模式,噴霧壓力413685.6Pa,干燥氣流量為5L/min,干燥氣溫度350℃,氣化溫度450℃,毛細管電壓3500V,電暈電流4000nA。2結(jié)果與分析2.1衍生化溶劑及溫度以二甲亞砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氫呋喃(THF)、1,4-二氧六環(huán)、甲醇和乙腈等作為衍生化溶劑,比較了類固醇的衍生產(chǎn)率,結(jié)果表明在DMSO和DMF中衍生化產(chǎn)率很低,可能是催化劑乙酸在2種溶劑中容易產(chǎn)生質(zhì)子化反應(yīng),使之失去催化活性的結(jié)果。THF、1,4-二氧六環(huán)衍生產(chǎn)率處于中等水平,甲醇和乙腈衍生產(chǎn)率最大,考慮到乙腈對衍生化產(chǎn)物具有較大的溶解度,因此選擇乙腈作為衍生化溶劑。催化劑的催化活性以硫酸、甲酸、冰醋酸、三氯乙酸和三氟乙酸為對象進行了考察,結(jié)果表明三氯乙酸具有最高的催化活性(圖3)。對衍生化溫度的考察表明;溫度的升高衍生化產(chǎn)率增大,當(dāng)溫度達到65℃時,衍生產(chǎn)率達最大值,進一步提升溫度將會引起試劑輕度分解導(dǎo)致產(chǎn)率下降。對衍生試劑用量的考察表明,衍生產(chǎn)率隨著試劑用量的增大而提高,當(dāng)衍生試劑為總摩爾類固醇的10倍以上時,產(chǎn)率恒定(圖4)。2.2不同的化合物基鄰位按上述優(yōu)化條件,4種類固醇標(biāo)品衍生物的色譜分離結(jié)果見圖5。盡管衍生后產(chǎn)生多個雜質(zhì)峰,但通過調(diào)整流動相配比,使其保留值落入20～40min,雜質(zhì)峰對4種類固醇衍生物均不產(chǎn)生干擾。理論上,皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮和孕酮分子中的C-3和C-20位羰基都有與試劑發(fā)生反應(yīng)的可能性,但通過對4種類固醇衍生產(chǎn)物的質(zhì)譜掃描可以發(fā)現(xiàn):試劑主要與分子中的C-3位羰基反應(yīng),C-20位上的羰基即使進行長達5h的衍生反應(yīng),其轉(zhuǎn)化率與C-3位的羰基相比也不足1%,說明2-(11H-苯﹝a﹞卡唑)-乙基肼基甲酸酯(BCECH)與類固醇中的C-3位羰基有較高的反應(yīng)活性。其可能的原因是C-20位處的羰基鄰位的甲基或羥基產(chǎn)生了較大的空間位阻作用,導(dǎo)致較低的反應(yīng)活性。此位阻效應(yīng)有利于在C-3位羰基上獲得高產(chǎn)率的單一衍生產(chǎn)物,有利于類固醇化合物的準(zhǔn)確定量。在線柱后質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明,各衍生物顯示出強烈的分子離子峰和相應(yīng)的特征碎片離子峰(圖6)。2.3%氧化木配制不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,進樣量為0.05～100.0pmol。根據(jù)峰面積和實際進樣量進行線性回歸,所得各類固醇衍生物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表1。2.4高效液相色譜圖分析在建立的色譜條件下,對藏羚糞便中類固醇激素的測定結(jié)果見圖7。測定藏羚糞樣中4種類固醇激素含量時,液相色譜圖有較多的雜質(zhì)峰,表明糞樣中的成分很復(fù)雜,然而通過與4中類固醇激素標(biāo)