下丘腦室旁核ap敏感性鉀離子通道在大鼠炎性痛中的作用

下丘腦室旁核ap敏感性鉀離子通道在大鼠炎性痛中的作用

炎性痛的相關因素包括周圍組織損傷、缺血、缺氧和酸中毒。臨床治療中的炎癥疼痛是醫(yī)生面臨的難題。目前的研究主要集中在炎性痛與受體、離子通道、神經遞質的關系上。在炎性痛條件下,傷害性神經遞質,如組胺和5-羥色胺等的釋放增加,刺激了外周和中樞神經系統(tǒng)傷害性感受器,從而提高神經細胞的興奮性,增加背根神經節(jié)、脊髓和腦組織痛相關物質的表達。ATP敏感性鉀離子通道廣泛表達于中樞神經元,并調節(jié)其膜興奮性、神經遞質的釋放和參與神經保護。研究表明,側腦室內注入KATP通道開放劑克羅卡林和吡那地爾可以增強皮下注射嗎啡引起的鎮(zhèn)痛作用,這種增強效應可以被KATP通道特異性阻斷劑格列本脲消除,提示這種鎮(zhèn)痛作用的發(fā)揮與KATP通道有關。DAMGO(一種μ阿片受體激動劑)注入丘腦中央下核(thalamicnucleussubmedius,Sm),減少脊髓背角c-Fos表達和抑制畏懼行為,而這種效應可以被核團內預先注射格列本脲所阻斷。這說明KATP通道可能在脊髓上水平參與疼痛信號調控。越來越多的研究顯示,下丘腦室旁核參與疼痛調控。因此,本研究采用一種常用的動物疼痛模型———CFA誘導的炎性痛模型,用免疫組織化學的方法觀察炎性痛條件下下丘腦室旁核神經元中KATP通道的表達變化和傷害性行為相關的脊髓背角c-Fos的表達,為進一步理解炎性痛的發(fā)病機制及探討KATP通道在炎性痛中的作用提供參考。1材料和方法1.1各類抗兔、二氮嗪和金屬酶兔抗kir6.2一抗(1∶200,AlomoneLabs,以色列);c-Fos一抗(1∶400,Abcam,美國);FITC標記的驢抗兔(1∶200,Millipore公司,美國);組化試劑盒(北京中杉);二氮嗪(Sigma,美國);激光共聚焦顯微鏡(FV1000,Olympus,日本);熱痛敏刺激儀(IITCseries8-390型,中國醫(yī)學科學院生物工程研究所生產)。1.2動物的使用原則Sprague-Dawley大鼠,♂,250~280g,由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。飼養(yǎng)在12h/12h明暗光線交替、22~24℃的安靜環(huán)境中,自由進食、水。所有實驗均遵守《實驗動物使用規(guī)范》。采用隨機數(shù)字法分為5組(每組6只):正常組(Normal組)、完全弗氏佐劑致炎性痛組(CFA組)、生理鹽水對照組(Saline組)、KATP通道特異性激動劑二氮嗪組(Diaoxide組)和激動劑溶媒對照組(Vehicle組)。1.3慢性炎性痛模型的建立將大鼠輕輕固定,用100μl微量注射器,盡快將用生理鹽水稀釋后的100μl濃度為50%的完全弗氏佐劑(CFA)注入大鼠左側后肢足底中心皮下,建立慢性炎性痛模型。對照組僅足底皮下注射生理鹽水100μl。CFA足底注射后大鼠產生典型的外周炎癥表現(xiàn),包括:注射局部的紅、腫、疼痛等,持續(xù)時間大于1周。1.4大鼠側腦室模型在致炎后d3,大鼠直接以水合氯醛麻醉(300mg·kg-1體重,ip),參照《大鼠腦立體坐標圖譜》(PaxinosandWatson),于立體定位儀(日本)上向大鼠一側側腦室[前囟:(-1.6~1.8)mm;深:(7.8-8.0)mm;中縫向左右旁開(0.3-0.6)mm]注射二氮嗪(diaoxide)25ng(溶于0.3μl0.5%DMSO中)。注射后15、30、60、240min后檢測熱痛閾。1.5熱痛敏刺激法在相同的時間段、相同的室內溫度和濕度下進行測定。按照Hargreaves法,將大鼠放置于3mm厚的15cm×15cm×15cm的有機玻璃箱中,待大鼠在其中適應30min安靜后,用熱痛敏刺激儀照射大鼠左后肢足底后外側。從照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避的時間為TWL。光源刺激強度恒定不變。自動切斷時間為25s,以防止組織損傷。每只動物連續(xù)測定5次,測量間隔3min,取后3次比較平穩(wěn)的數(shù)據平均值為大鼠TWL。1.6腰髓細胞處理u2004大細胞菌群的表達大鼠用10%水合氯醛(300mg·kg-1)腹腔注射麻醉后,經左心室-升主動脈插管,依次灌注37℃生理鹽水150ml沖洗和4℃、4%多聚甲醛溶液300ml固定,總灌注時間為1~1.5h。取大腦組織和脊髓后,放入4%多聚甲醛溶液中4℃后固定過夜;轉入30%蔗糖溶液中4℃脫水至組織沉淀。冰凍連續(xù)冠狀切片,熒光片厚40μm,取相應腦組織節(jié)段的切片;取腰脊髓L4-5節(jié)段切片,片厚30μm。用0.01mol·L-1PBS(NaCl8.0g,KCl0.2g,NaH2PO40.24g,Na2HPO43.63g;pH7.4)沖洗切片3次×5min/次。1.7抗c-fos一抗兔模型選取完整切片至24孔孵育板中,加入含0.3%Triton-100的10%驢血清封閉液,室溫封閉2h;加入兔抗kir6.2一抗(1∶200)或兔抗c-Fos一抗(1∶400),4℃孵育48h;0.01mol·L-1的PBS沖洗3次×5min/次;暗室中加入FITC標記的驢抗兔(1∶200),4℃孵育過夜,0.01mol·L-1的PBS沖洗3次×5min/次,貼片、室溫干片、50%甘油封片,激光共聚焦顯微鏡避光下放大100倍、400倍,對腦和脊髓組織切片進行觀察并攝片。免疫對照組用PBS代替一抗,其余步驟同前。1.8兩組part陽性小鼠骨髓ca-c-fos陽性細胞計數(shù)免疫熒光染色切片采用激光共聚焦顯微鏡技術觀測。光鏡切片細胞計數(shù)方法:各例動物取相同層面KATP陽性細胞最集中的4張腦和脊髓組織切片,于100倍放大,在固定部位截取一屏(脊髓組織取脊髓背角Ⅰ、Ⅱ板層恒定位置)分別計數(shù)KATP陽性和c-Fos陽性細胞數(shù),用于統(tǒng)計學分析。1.9統(tǒng)計學處理方法所有計量資料均用ue0af±s表示,采用SPSS13.0軟件對實驗數(shù)據進行統(tǒng)計分析,并生成統(tǒng)計圖表。每個時間點多組比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA),組間兩兩比較采用q檢驗;兩組比較采用t檢驗。2結果2.1兩組大鼠ldb、ld50、kCFA組和Saline組之間,術前TWL差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。左側足底皮下注射CFA致炎后d1、d3、d7,TWL明顯降低,低于術前的基礎值(P<0.01);與Saline組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時伴有患足紅腫、行走困難及提縮患爪等一些保護性行為,而且這一效果持續(xù)至少3d,然后才逐漸減輕。Saline組大鼠術前和術后的TWL未見明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。CFA致炎后d3、d7,腰段脊髓背角的c-Fos表達明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見Fig1、2。2.2fa致炎后兩組大鼠腦片中katp陽性細胞數(shù)的比較CFA組和生理鹽水組均可見KATP陽性細胞。CFA致炎后d3和d7,大鼠腦片中計數(shù)到的KATP陽性細胞數(shù)明顯小于Saline組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見Fig3。2.3在dvn中注射特定的c-fos緩沖液后，大鼠的疼痛行為以及脊柱后部的c-fos的高度3part的藥物作用ATP敏感性鉀離子通道是一種受神經遞質或細胞內ATP調控的內向整流鉀通道,ATP濃度升高時其開放率明顯下降?，F(xiàn)有的研究顯示,KATP通道存在于大鼠的中樞神經元及脊髓背角神經元上,調節(jié)神經元的興奮性和神經遞質的釋放,可能與疼痛調控的相關機制有關。Wu等研究發(fā)現(xiàn)坐骨神經慢性壓迫性損傷(chronicconstrictioninjuryofthesciaticnerve,CCI)術后,在神經損傷的同側可發(fā)現(xiàn)脊髓背角KATP亞基表達均下調,伴隨著熱痛和機械痛覺過敏;足底局部注射KATP通道激動劑磺脲類藥物能拮抗足底注射低劑量雙氯芬酸對福爾馬林致炎性痛的治療效應。這些研究都說明KATP通道參與了疼痛的發(fā)生過程。本實驗采用了一種常用的實驗動物模型,CFA誘導的炎性痛。該模型能成功模擬病理性疼痛典型的自發(fā)痛、痛覺過敏和觸誘發(fā)痛等癥狀,并維持一段時間,結果證實,大鼠CFA致炎后d1TWL即降低,直到d3都維持在較低水平。研究表明,生理性刺激大鼠初級感覺神經元能引起脊髓背角突觸后神經元的c-Fos表達,傷害性熱刺激也能升高脊髓背角Ⅰ、Ⅱ板層c-Fos的表達,而嗎啡預處理可以減少上述c-Fos的表達。這從另一方面說明藥物對疼痛的治療作用也可以通過免疫組化標記c-Fos來反映。c-Fos表達可作為傷害性刺激后疼痛傳導和調控的標志,c-Fos表達與疼痛狀態(tài)相對應。我們的研究發(fā)現(xiàn),免疫組化顯示,CFA注射同側的脊髓背角有c-Fos表達且主要表達在與疼痛相關的L4-5脊髓Ⅰ、Ⅱ板層,這些結果和上述關于c-Fos的相關研究一致;注射CFA后c-Fos表達增加,d3表達最高,這和疼痛行為學結果一致,從形態(tài)學上證明CFA炎性痛模型的成功。研究結果表明,疼痛模型下,疼痛信號相關解剖結構的KATP通道蛋白表達下降;本實驗免疫熒光結果顯示,在炎性痛條件下,下丘腦室旁核KATP通道表達下降,d3下降最明顯,這與疼痛行為學變化是一致的。這說明室旁核KATP通道可能參與炎性痛的發(fā)生過程。疼痛最明顯的d3,室旁核注射KATP通道特異性激動劑二氮嗪能逆轉CFA致炎引起的熱痛敏,同時可減輕疼痛誘發(fā)的脊髓背角c-Fos的表達,進一步為室旁核KATP通道參與炎性痛的調控提供證據。在脊髓水平,去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)通過激活中間神經元的內源性阿片受體,阿片受體進一步激活KATP通道,從而產生抗傷害性刺激的作用。實驗表明,電刺激引起的疼痛模型下,下丘腦內源性相關肽(甲硫氨酸腦啡肽、β內啡肽)水平增加,而研究證實大鼠下丘腦室旁核NE在疼痛的調控過程中發(fā)揮重要作用,結合本實驗的研究結果,我們推測下丘腦室旁核KATP通道可能是通過NE激活室旁核的內源性阿片肽受體,從而進一步激活KATP通道,參與炎性痛發(fā)生和調控的過程。綜上所述,通過對下丘腦室旁核KATP通道表達與炎性痛引起的機械痛和熱痛敏之間的關系的研究,我們推測下丘腦室旁核KATP通道可能參與疼痛的發(fā)生和調控過程,為炎性痛的發(fā)生機制及治療提供新的線索,為臨床治療炎性痛提供新的參考。外周